Никол К. Харис

От Програмата за туморна ангиогенеза, Раков център на Питър Маккалъм, Източен Мелбърн, Виктория 3002, Австралия,

пропептидите

§ Институтът за изследване на рака Лудвиг, болница Роял Мелбърн, Парквил, Виктория 3050, Австралия и

Наталия Давидова

От Програмата за туморна ангиогенеза, Раков център на Питър Маккалъм, Източен Мелбърн, Виктория 3002, Австралия,

Сали Руфейл

От Програмата за туморна ангиогенеза, Раков център на Питър Маккалъм, Източен Мелбърн, Виктория 3002, Австралия,

Софи Пакет-Фифийлд

От Програмата за туморна ангиогенеза, Раков център на Питър Маккалъм, Източен Мелбърн, Виктория 3002, Австралия,

Кари Паавонен

§ Институтът за изследване на рака Лудвиг, болница Роял Мелбърн, Парквил, Виктория 3050, Австралия и

Тара Карнезис

От Програмата за туморна ангиогенеза, Раков център на Питър Маккалъм, Източен Мелбърн, Виктория 3002, Австралия,

You-Fang Zhang

От Програмата за туморна ангиогенеза, Раков център на Питър Маккалъм, Източен Мелбърн, Виктория 3002, Австралия,

Терухико Сато

От Програмата за туморна ангиогенеза, Раков център на Питър Маккалъм, Източен Мелбърн, Виктория 3002, Австралия,

Джули Ротакер

§ Институтът за изследване на рака Лудвиг, болница Роял Мелбърн, Парквил, Виктория 3050, Австралия и

Edouard C. Nice

§ Институтът за изследване на рака Лудвиг, болница Роял Мелбърн, Парквил, Виктория 3050, Австралия и

Стивън А. Стакер

От Програмата за туморна ангиогенеза, Раков център на Питър Маккалъм, Източен Мелбърн, Виктория 3002, Австралия,

§ Институтът за изследване на рака Лудвиг, болница Роял Мелбърн, Парквил, Виктория 3050, Австралия и

¶ Сър Питър Маккалъм, Отдел по онкология, Университетът в Мелбърн, Парквил, Виктория 3050, Австралия

Марк Г. Ахен

От Програмата за туморна ангиогенеза, Раков център на Питър Маккалъм, Източен Мелбърн, Виктория 3002, Австралия,

§ Институтът за изследване на рака Лудвиг, болница Роял Мелбърн, Парквил, Виктория 3050, Австралия и

¶ Сър Питър Маккалъм, Отдел по онкология, Университетът в Мелбърн, Парквил, Виктория 3050, Австралия

Резюме

Въведение

Ангиогенезата и лимфангиогенезата са ключови процеси в ембриогенезата, зарастването на рани и имунната функция, както и при заболявания, включително метастатичен рак, възпалителни нарушения и лимфангиолейомиоматоза (LAM) 2 (1–4). Членовете на VEGF семейството на секретирани гликопротеини насърчават лимфангиогенезата и/или ангиогенезата чрез активиране на тирозин кинази на клетъчната повърхност на ендотелните клетки, като VEGF рецептор (VEGFR) -2 и VEGFR-3. Например, човешкият VEGF-D активира както VEGFR-2, така и VEGFR-3 (5) и стимулира растежа на кръвоносните съдове и лимфната система в различни настройки (6–12). В животински модели на рак, експресията на VEGF-D насърчава растежа на кръвоносните съдове и малките лимфни пътища в и около тумори, улеснявайки растежа на тумора и подобрявайки метастази в лимфните възли и отдалечени органи (13–15). VEGF-D също така насърчава разширяването на отвеждащите тумори лимфати, което улеснява транспортирането на туморни клетки и допълнително подобрява метастазирането (16).

VEGF-D се експресира в редица човешки тумори и може да корелира с метастази в лимфните възли и лош изход на пациента (Референции 17–21); за преглед вж. 2, 22). Клиникопатологичните, както и експерименталните данни показват, че VEGF-D сигналният път може да бъде терапевтична цел за ограничаване на разпространението на рака (23, 24). Освен това се предполага, че VEGF-D е алтернативен медиатор на туморната ангиогенеза на VEGF-A (25, 26), който може да допринесе за механизмите на резистентност към бевацизумаб, широко използвано противораково лекарство, насочено към VEGF-A (27 ). Анализът на VEGF-D в клинични проби, като туморни тъкани, се усложнява от факта, че това е протеолитично обработен протеин (28), който може да бъде открит в различни форми с различни размери и състав на субединицата. От съществено значение е да се разберат функциите на различните домейни на VEGF-D, за да се разработят оптимални терапевтични и диагностични подходи, насочени към клинично важната форма (и) на протеина.

Доказано е, че протеолитичната обработка е абсолютно необходима за VEGF-D-медииран туморен растеж и разпространение (34); обаче малко се знае за функциите на пропептидите в тези събития. Анализът на пропептидната функция се усложнява от трудността при пречистването или специфичното експресиране на частично обработен VEGF-D (в който или пропептидът е отделен от VHD) при липса на материал с пълна дължина или зрял материал (28, 34). Тук заобикаляме този проблем, използвайки форми на VEGF-D, при които или пропептидът е бил изтрит, и обработката на другия пропептид е блокирана от мутация. Това ни позволи да тестваме хипотезата, че пропептидите модулират различни взаимодействия на VEGF-D и неговите ефекти върху рака. Ние показваме, че пропептидите определят свързването на VEGF-D с хетеродимери на VEGF рецептора, ко-рецептори и хепарин и влияят върху ключови аспекти на туморната биология, като скорост на първичен туморен растеж и метастази.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ПРОЦЕДУРИ

Клетъчна култура

293EBNA-1 и човешките микроваскуларни ендотелни клетки (HMVECs) са култивирани както преди (28, 34) и Suspension Freestyle TM 293-F клетки според доставчика (Invitrogen, Carlsbad, CA).

VEGF-D протеинови конструкции

Производните на VEGF-D, използвани в това проучване, са както следва. (i) VEGF-DSSTS.IISS: N-терминално маркирана с FLAG форма с пълна дължина на човешка VEGF-D, съдържаща мутации в протеолитичните места на разцепване, които предотвратяват разцепването на двата пропептида (29); (ii) VEGF-DΔNΔC: зряла форма на човешки VEGF-D, състояща се от VHD, маркирана с FLAG в N-края (5, 28); (iii) VEGF-D-CPRO: С-терминалният пропептид на човешки VEGF-D (аминокиселинни остатъци 206–354), маркиран в N-края с FLAG (35); (iv) VEGF-DΔNIISS: N-терминална FLAG-маркирана форма на VEGF-D (обхващаща аминокиселини 89–354) без N-краен пропептид и съдържаща мутации (R204S и R205S), които предотвратяват разцепването на С-терминала пропептид; (v) VEGF-DΔCSSTS: N-терминална FLAG-маркирана форма на VEGF-D (обхващаща аминокиселини 24–205) без C-терминален пропептид и съдържаща мутации (R85S и R88S), които предотвратяват разцепването на N-терминала пропептид. VEGF-DΔNIISS и VEGF-DΔNΔC съдържат N-терминалната област на VHD, за която се смята, че е важна за взаимодействие с VEGFR-3 (36). Експресионните вектори за тези протеини са генерирани от pApex-3 (Alexion Pharmaceuticals, Cheshire, CT).

Трансфекция и пречистване на протеини

293EBNA-1 клетки бяха трансфектирани и избрани стабилно експресиращи клонове, както е описано (34). 293F клетки бяха трансфектирани според доставчика (Invitrogen). VEGF-D протеините се пречистват от кондиционирана среда чрез афинитетна хроматография върху М2 (анти-FLAG) гел, както е описано по-горе (28), и се определя количествено спектрофотометрично.

Имунопреципитация и Western Blotting

Производните на VEGF-D бяха имунопреципитирани и открити в Western blots, както е описано (33, 34). За анализ на VEGFR-2/VEGFR-3 хетеродимери, HMVECs се третират с растежни фактори в продължение на 10 минути, след което клетките се лизират в продължение на 15 минути в ледено студен буфер (1% Nonidet P-40, 20 mm Tris-HCl, pH 8,0, 137 mm NaCl, 10% глицерол, 2 mm EDTA, 1 mm активиран натриев ортованадат, 10 μg/ml апротинин и 10 μg/ml левпептин). VEGFR-2 беше имунопреципитиран и насочен в Western blots с mab към C-края на човешки VEGFR-2 (55B11, Cell Signaling Technologies, Beverly, MA) и VEGFR-3 с поликлонално антитяло към C-края на човешки VEGFR- 3 (sc-321, Санта Круз Биотехнология Инк., Санта Круз, Калифорния). Остатъците от фосфотирозин бяха насочени с маб срещу фосфотирамин (4G10, Millipore, Billerica, MA) и VEGF-A с маб срещу VEGF-A165 (Santa Cruz Biotechnology Inc.). За откриване бяха използвани вторични 800 конюгирани с IRDye® IgG антитела (LI-COR Biosciences, Lincoln, NB). Протеините се визуализират и се измерва относителната интензивност на лентата на инфрачервена система за изображения на Odyssey (LI-COR Biosciences).

Анализ на биосензора
ELISA за активиране на рецептора

HMVECs бяха стимулирани с растежни фактори за 10 минути и проби, използвани в тотални и фосфо VEGFR-2 или VEGFR-3 ELISA (R&D системи, Минеаполис, MN) според инструкциите на производителя.

Хепаринова афинитетна хроматография

Протеините се зареждат в 1-милилитрова колона хепарин-сефароза (GE Healthcare). Колоната се измива с PBS за отстраняване на несвързания протеин и свързаният протеин се елуира с 0.1–2.0 М градиент на NaCl в PBS във фракции от 2 ml, които впоследствие се анализират чрез Western blotting.

Свързване с невропилини

Свързването на производни на VEGF-D с невропилини беше оценено с помощта на слети протеини, състоящи се от извънклетъчните домейни на невропилин-1 или човешки невропилин-2 и Fc част от човешки IgG (R&D Systems, Minneapolis, MN), както е описано по-горе ).

Модел на тумор на мишка Xenograft

Използвани са женски SCID/NOD мишки (Animal Resources Center, Perth, Australia), на възраст 11–12 седмици. Туморите се генерират чрез инжектиране на подкожно клетъчни линии 293EBNA-1 в мишния фланг и обемът на тумора се определя, както е описано (13). Всяка изследователска група съдържа 10 мишки и експериментът е проведен два пъти с подобни резултати във всеки случай. Откриването на PECAM-1 или LYVE-1 в тъканни секции, имунопреципитация и Western bloting на туморната тъкан за проследяване на нивата на VEGF-D протеини и откриване на туморни клетки в лимфните възли се извършват, както е описано по-рано (34), когато първичните тумори достигнат,500 2500 мм 3. Статистическите анализи са както е описано по-рано (34).

РЕЗУЛТАТИ

Експресионно и рецепторно свързване на VEGF-D пропептидни мутанти

За да се изследва ролята на пропептидите в молекулярните взаимодействия и биологичните функции на VEGF-D, са създадени мутанти, в които или пропептидът е бил изтрит, и мястото за обработка на останалия пропептид мутира, за да блокира обработката. Тези протеини, маркирани с октапептида FLAG, бяха обозначени като VEGF-DΔNIISS и VEGF-DΔCSSTS и са представени на фиг. 1 А. Експресията на тези протеини в клетките 293F или 293EBNA-1 и намаляването на SDS-PAGE анализа разкриха, че субединици на VEGF-DΔNIISS и VEGF-DΔCSSTS са съответно ∼43 kDa и ∼31 kDa (фиг. 1 B), както се очаква въз основа на известните размери на VHD и пропептидите (28). Нито един от протеините не е обработен, за да генерира зрял VEGF-D, чиято субединица е ∼21 kDa (5).

VEGF-D пропептидите определят хетеродимеризацията на рецептора и взаимодействията с невропилини

VEGF-D индуцира образуването на VEGFR-2/VEGFR-3 хетеродимери върху ендотелните клетки, за които се смята, че регулират положително ангиогенното покълване (39), въпреки че не е ясно кои форми на VEGF-D насърчават тази хетеродимеризация. За да се наблюдава влиянието на пропептидите върху образуването на VEGFR-2/VEGFR-3 хетеродимери, HMVECs бяха стимулирани с VEGF-D варианти и рецепторни хетеродимери, оценени чрез имунопреципитация и Western blotting (Фиг. 2 А). VEGFR-2/VEGFR-3 хетеродимери се индуцират или от VEGF-DΔNIISS, или от VEGF-DΔCSSTS при 500 ng/ml, но не и при 200 ng/ml (данните не са показани). За разлика от това, не са наблюдавани рецепторни хетеродимери след стимулация с VEGF-DSSTS.IISS при 500 ng/ml. Както се очаква от предишни проучвания (39), VEGF-DΔNΔC при 200 ng/ml индуцирани рецепторни хетеродимери. Тирозин фосфорилиране както на VEGFR-2, така и на VEGFR-3 се наблюдава в отговор на всички форми на тествани VEGF-D (фиг. 2 А), с изключение на това, че VEGF-DSSTS.IISS не предизвиква VEGFR-2 фосфорилиране. Тези резултати показват, че VEGF-DΔNIISS и VEGF-DΔCSSTS активират VEGFR-2 и VEGFR-3 и стимулират образуването на хетеродимер, но предполагат, че обработката за отстраняване на двата пропептида засилва тези ефекти.

Съобщава се, че частично обработен, но не в пълна дължина, VEGF-D свързва невропилин (NP) 1 и NP2 (34, 40), които действат като ко-рецептори с VEGFR-2 и VEGFR-3 (41, 42) и са ключови молекули в развитието на кръвоносните съдове и лимфната система (43, 44). За по-нататъшно характеризиране на свързването на VEGF-D с NPs, тествахме способността на вариантите на VEGF-D да свързват слети протеини, съставени от извънклетъчните домени на NP1 или NP2 и Fc частта на човешкия IgG1 (фиг. 2 B). Тези експерименти са проведени в присъствието или отсъствието на хепарин, молекула, която може да бъде необходима за свързване на VEGF-C с NP1 (40). VEGF-DΔNIISS не свързва нито конструкцията NP1, нито NP2, независимо от наличието или отсъствието на хепарин, но VEGF-DΔCSSTS свързва и двете конструкции. Хепаринът леко засилва свързването на VEGF-DΔCSSTS с NP2, но не и с NP1. За по-нататъшна оценка на домейна (ите) на VEGF-D, който свързва NPs, се използват NP конструкции за утаяване на VEGF-DΔNΔC. VEGF-DΔNΔC свързва NP1 и NP2, взаимодействия, които са леко засилени от хепарин. Въпреки това, свързването на VEGF-DΔCSSTS с NP1 и NP2 генерира по-интензивни ленти, което показва, че N-терминалният пропептид усилва NP взаимодействията.

С-терминалният пропептид медиира свързването на хепарин

Анализ на свързването с хепарин. Свързването на варианти на VEGF-D и VEGF-A165 с хепарин се анализира чрез афинитетна хроматография. Пречистените протеини се зареждат върху хепарин-сефарозни колони и се събира потока (FT), съдържащ несвързан протеин. Свързаните протеини се елуират от колони, като се използват буфери с повишаваща се концентрация на NaCl (М), както е посочено над петна. Фракциите се анализират чрез намаляване на SDS-PAGE и Western blot с антитела, насочени към FLAG, за откриване на варианти на VEGF-D или с анти-VEGF-A антитяло. Пречистените протеинови проби (S), които не са били подложени на афинитетна хроматография с хепарин Сефароза, са показани за сравнение. Размерите на маркери за молекулно тегло (kDa) са показани вляво.

Пропептидите влияят върху растежа на първичния тумор и ангиогенезата

Ендотелът на кръвоносните съдове в туморите се определя количествено чрез имунооцветяване за PECAM-1 (фиг. 4 D). Няма статистически значима разлика в оцветяването между VEGF-DΔNΔC и VEGF-DΔCSSTS тумори и двете туморни групи съдържат значително повече ендотел на кръвоносни съдове, отколкото VEGF-DΔNIISS или Vector Control тумори. Като се има предвид, че VEGF-DSSTS.IISS не насърчава ангиогенезата в този модел (34), тези данни показват, че премахването на С-крайния пропептид, но не и N-крайния пропептид, от VEGF-D с пълна дължина насърчава ангиогенезата, която вероятно е довела до бързия растеж на VEGF-DΔCSSTS тумори.

Пропептидите влияят върху метастазите в лимфните възли и туморната лимфангиогенеза

Тъй като VEGF-D може да насърчи метастази в лимфните възли (13), аксиларните лимфни възли бяха оценени за наличие на туморни клетки, които лесно се идентифицираха поради тъмното им оцветяване, увеличените ядра и неправилната форма (фиг. 5 А). Експресията на VEGF-DΔNΔC в тумори значително подобрява метастазирането в лимфните възли в сравнение с Vector Control туморите, които не показват никакво метастатично разпространение в лимфните възли (фиг. 5 Б). Когато туморите експресират VEGF-DΔNIISS или VEGF-DΔCSSTS, метастатично разпространение в лимфните възли наистина се получава, но е значително намалено в сравнение с VEGF-DΔNΔC тумори. Тези открития показват, че премахването на двата пропептида е необходимо за VEGF-D, за да се насърчи най-ефективно метастазирането в лимфните възли.

ДИСКУСИЯ

NP1 и NP2 действат като ко-рецептори с VEGFR-2 и VEGFR-3 (41, 42) и са важни по време на ембриогенезата за развитието на кръвоносните съдове и лимфната система (43, 44). Вече беше известно, че VEGF-D с пълна дължина не може да свързва NP, но обработката на С-крайния пропептид позволява свързване (34, 40). Тук показваме, че зрелият VEGF-D се свързва както с NP1, така и с NP2 и че свързването се засилва и за двата рецептора от присъствието на N-крайния пропептид (т.е. VEGF-DΔCSSTS се свързва по-добре от VEGF-DΔNΔC). Въпреки това, С-терминалният пропептид инхибира свързването към двете NP, т.е. VEGF-DΔNIISS не може да свързва NP, въпреки наличието на VHD. Инхибиторният ефект на С-крайния пропептид също обяснява защо VEGF-D с пълна дължина не свързва NP.

Нашите данни показват, че пропептидите на VEGF-D са критични детерминанти на хетеродимеризацията на VEGF рецептора и взаимодействията с невропилиновите ко-рецептори и хепарина. Пропептидите оказват дълбоко въздействие върху способността на VEGF-D да задвижва туморната ангиогенеза и лимфангиогенезата и по този начин насърчават растежа и разпространението на рака.

* Тази работа беше подкрепена от стипендии за програма и научни стипендии (за SAS и MGA) от Националния съвет за здравни и медицински изследвания на Австралия, стипендия за научни изследвания в Мелбърн (към NCH) и средства от Програмата за подкрепа на оперативната инфраструктура, предоставена от викторианското правителство, Австралия. S. A. S. и M. G. A. са консултанти на Vegenics Ltd., компания, разработваща противоракови терапевтични средства.

Тази статия съдържа допълнителна фигура S1.