Резюме

Салмонелата е една от основните патогенни бактерии, които причиняват хранително отравяне. Това проучване изследва дали убитите от топлина, както и живите Lactobacillus предпазват гостоприемника от инфекция със салмонела. Lactobacillusacidophilus на живо и на топлина се прилага перорално на плъхове Sprague-Dawley в продължение на 2 седмици преди плъховете да бъдат инокулирани със Salmonella. Повишаването на телесната температура е умерено в групата, която е била третирана с топлинно убити бактерии в сравнение с контролната група за салмонела. Средното количество прием на храна и консумация на вода за всеки плъх от групата на убитите от топлина бактерии са почти нормални. Броят на фекалните салмонели е сравним между живите и убитите от топлината групи L. acidophilus. Това откритие показва, че L. acidophilus улеснява отделянето на салмонела. Нещо повече, нивата на провъзпалителни цитокини, включително тумор некрозис фактор (TNF) -алфа и интерлевкин (IL) -1 бета, в групата на убитите с топлина L. acidophilus са значително по-ниски в сравнение с нивата в контролната група за салмонела. Тези резултати показват, че нежизнеспособните млечнокисели бактерии също могат да играят важна роля за предотвратяване на инфекции от ентерични патогени като салмонела.

ВЪВЕДЕНИЕ

Салмонелата е ентеричен бактериален патоген и основна патогенна бактерия, която причинява хранително отравяне. Начините му на заразяване включват замърсени храни и вода. Салмонелата е грам-отрицателен бацил, причинява паратифоидна треска, хематосепсис и гастроентерит като хранителни отравящи патогени (1,2) и тези патогени често се противопоставят на антибиотици като тетрациклин, триметоприм-сулфаметоксазол и стрептомицин (3,4). Известно е, че салмонелата има около 2500 серотипа, включително най-често срещаните Typhi и Typhimurium. Typhi е серотип на салмонела, който причинява салмонелоза при хората. Salmonella typhimurium, която беше използвана в това проучване, причинява салмонелоза при мишки, така че е полезен щам, който често се среща при бактериални инфекции при животни (5).

В имунната система макрофагът отговаря за имунните отговори, включително вродени и адаптивни имунни отговори срещу инфекции във всички защитни системи на гостоприемника. Когато патогенът се доближи до епителната бариера, макрофагът произвежда цитокини, за да индуцира фагоцитоза, като фактор на туморна некроза (TNF) -алфа (6). По-специално, TNF-алфа играе важна роля в имунните отговори на гостоприемника и грам-отрицателните бактериални инфекции (7). Той се използва и като важен параметър в животински модели на инфекция със салмонела. Известно е, че нивото на TNF-алфа при бебета, заразени със салмонела (8).

Проучванията за инхибиране на салмонела, използващи млечнокисели бактерии (LAB), често се фокусират върху следните теми: лечение на хранително отравяне с използване на бактериоцин, който инхибира патогени (9), имунитета, придобит чрез имунологичните комуникации между LAB и чревните епителни клетки (10) и лечение или профилактика на хранително отравяне чрез инхибиране на пребиваването на патогените в дебелото черво чрез коагрегация, автоагрегация, адхезия на чревни клетки и бактериална адхезия към въглеводороди (11).

В това проучване се извършва коагрегация на живи и убити с топлина (hk) LAB, като се използва хидрофобност и са избрани LAB с най-добра способност за коагрегация, за да се изследва превенцията на инфекция със салмонела при животински модел.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Препарат LAB и S. typhimurium. За LAB, Lactobacillus acidophilus 11869BP, който се използва и се прилага перорално веднъж на два дни в това проучване, е култивиран от CELLBIOTECH Co. Ltd. (Gimpo, Корея). LAB се инокулира в MRS бульон (Difco, Детройт, Мичиган, САЩ) и се култивира при 37 ° С за 18

24 часа и след това се измива два пъти със стерилен физиологичен разтвор, за да се отстранят всички метаболитни вещества, свързани с него. След това беше убит чрез автоклавиране при 121 ℃ за 15 минути. разтворът на hk LAB беше лиофилизиран и разтворен във физиологичен разтвор преди употреба (12). Salmonella typhimurium is NCCP 10725 е използван през цялото това проучване. Това размножаване на щам (при 200 rpm) в инфузионен бульон от мозъчно сърце (Difco, Детройт, Мичиган, САЩ) в продължение на 18-24 часа при 37 ℃ при аеробни условия, събрано чрез центрофугиране (3200 × g, 4 ℃, 20 минути), след което беше подкласен - култивиран веднъж в еднотипна прясна среда.

Клетъчни култури. Клетъчните линии на аденокарцинома на човешкото черво на дебелото черво HT-29 (KCLB 30038; Сеул, Корея) се култивират в RPMI1640, които са допълнени с 10% фетален говежди серум (FBS; HyClone, Logan, UT, USA) и пеницилин/стрептомицин 1% (Invitrogen, Grand Island, NY, САЩ). Клетките се култивират при 37 ℃ в атмосфера от 5% CO2 и 95% въздух.

Ин витро тест за способността за коагрегация. Анализът на коагрегацията се извършва съгласно Handley et al. (13). За измерване на способностите за коагрегация на LAB живи и hk бактерии и салмонела, всеки OD на LAB бактериите и салмонелата се приготвя при 0,5. А смесите от Salmonella typhimurium и живите или hk LAB бактерии се култивират в продължение на два часа за измерване на нивата на OD (14). След това способностите за коагрегация бяха измерени, като се използва следното уравнение.

A: абсорбция при 600 nm, sal: Salmonella typhimurium, lac: lactobacillus acidophilus

Анализ на адхезията. Анализът на адхезията се извършва, както е описано от Jacobsen et al. (15). Всяка ямка от 12-гнездна тъканна културна плака се засява с клетки НТ-29. 500 μl DMEM без серум и антибиотици се добавят към всяка ямка и се инкубират при 37 ℃, CO2 5% за 1 час. Пробиотиците и S. typhimurium бяха отгледани за една нощ култури от бактерии бяха подходящо разредени (10 ×) с DMEM, за да се получи бактериална концентрация от приблизително 10 8 клетки/ml. Едновременно с това салмонела и жива или hk LAB се добавят за 1 час инкубация. След инкубация в продължение на 1 час, всички съдове бяха измити три пъти с буфериран с фосфат физиологичен разтвор, за да се освободят несвързани бактерии. И след това кладенецът се оцветява с комплект за оцветяване на грам (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ) и се наблюдава с микроскоп (× 1000).

Експериментални животни. Осемседмични бели мъжки плъхове Sprague-Dawley са закупени от Orient Bio (Seongnam, Корея). Те бяха настанени в клетки на групи от по пет. По време на едноседмичния период на адаптация, плъховете бяха подтикнати да приемат свободно пелетни фуражи и вода при условията на температура 24 ± 2 ℃, относителна влажност 40 ± 20% и 12-часов цикъл на осветление. Докато здравословното им състояние се проследява, изпражненията им се култивират в плоча на Salmonella-shigella (Difco, Детройт, Мичиган, САЩ) със селективна среда на S. typhimurium, преди неинфектираните плъхове да бъдат избрани чрез скрининг процес.

Перорално приложение на LAB. За да се изследват инхибиращите ефекти на пероралното приложение на LAB върху патогенната бактериална пролиферация, бяха подготвени шест експериментални групи, както е показано в Таблица 1, и девет плъха бяха назначени за всяка група. Цялата група беше лекувана, за да наруши първоначалната чревна флора с антибиотичен процес (ампицилин: 4 g/L) в продължение на три дни. И тогава L. acidophilus live и бяха подготвени бактерии hk. Започвайки две седмици преди приложението на патогенните бактерии, 1 × 10 9 и 1 × 10 10 CFU от 1 ml LAB се прилагат перорално на плъхове всеки ден в продължение на една седмица.

маса 1.

Проектиране на експерименталните групи въз основа на приложението на пробиотиците

Групи Състояние на приложение Лечение с пробиотици
NCНеприлагане-
SAНеприлагане след инокулация на патогена-
L.1.0E + 9Предварително приложение, всеки ден 2 седмици преди инокулация на патогенана живо 10 9 CFU
L.1.0E + 10Предварително приложение, всеки ден 2 седмици преди инокулация на патогенана живо 10 10 CFU
hk.1.0E + 9Предварително приложение, всеки ден 2 седмици преди инокулация на патогенатоплоубити 10 9 CFU
hk. 1.0E + 10Предварително приложение, всеки ден 2 седмици преди инокулация на патогенатоплоубити 10 10 CFU

Телесно тегло и телесна температура. След адаптационния период от една седмица, LAB се прилага на плъхове и телесното им тегло се измерва ежеседмично. Преди (0 часа) и след (24 часа) индуцирана от салмонела диария се измерва телесното тегло на плъховете, за да се потвърдят техните промени. Телесните температури на плъховете са измерени преди (0 часа) и след (1, 3, 6, 9, 12 и 24 часа) индуцираната от салмонела диария с помощта на животински ректален термометър за потвърждаване на промените.

Измерване на приема на фураж и консумацията на вода. Преди пероралното приложение на Salmonella се потвърждава количеството на храната и приема на вода от всеки плъх. За да се сравни количеството на приема на фураж преди и след диария, заразена със салмонела, количеството фураж е ограничено до 200 g на ден. Също така количеството вода също беше ограничено до 500 ml на ден.

Броят на живите салмонелни бактерии. За да се потвърди разпространението на патогенните бактерии, изпражненията на експерименталните животни бяха събрани асептично в метаболитна клетка за 24 часа. Един грам изпражнения от всяка група плъхове се хомогенизира в 9 ml физиологичен разтвор и се разрежда последователно 10 пъти с PBS. След хомогенизиране, фекалната материя се разрежда последователно и се нанася върху агар на MacConkey (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ). Агаровите плаки се инкубират при 37 ℃ за 24 часа и бактериите се отчитат като CFU/g фекална материя. Морфологията на колонията на салмонела в чиста култура и заразените изпражнения са сходни (16).

Анализ на цитокини. Три часа след пероралното приложение на патогенната бактерия S. typhimurium се вземат кръвни проби от орбитите на плъховете. Взетите кръвни проби се оставят при стайна температура в продължение на два часа и след това се центрофугират (4 ℃, 1500 × g, 15 минути), за да се отдели серумът. Пробите се държат при -80 ℃, докато се проведе анализ на цитокините. Серумът се размразява за анализ на серумния цитокин и провъзпалителният цитокин TNF-alpha и IL-1beta (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) се потвърждава чрез ELISA. Измерва се с помощта на инструмент i-Mark (Bio-Rad Laboratories, CA, USA).

Микроскопско наблюдение. За подготовката на чревните проби за патологично изследване, чревната тъкан се отрязва, фиксира се в 10% формалин за 24 часа и се промива с вода. Тъканта се дехидратира в алкохол (за 1 час всеки на 70, 80, 90 и 100%) и ксилол (3 стъпки, 1 час на всеки етап) и се влага в парафин. Парафиновият блок се нарязва с дебелина 7 μm, оцветява се с хематоксилин-еозин (H&E) (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО, САЩ) и след това се оцветява отново с комплект за оцветяване на грам (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния, САЩ ) и наблюдавани с микроскоп (× 1000).

проучване

36,7 ml прием на пречистена вода, което е по-малко от SA групата (фиг. 4 Б).

ДИСКУСИЯ

Най-сериозният проблем при лечението на салмонелоза с антибиотици е вторичното увреждане, причинено от мъртвата салмонела (17). Резистентната на антибиотици салмонела създава друг проблем (18). За да се преодолеят тези проблеми, антибиотиците трябва да се използват дискретно и да се преодолеят вторичните увреждания от мъртвата салмонела, в допълнение към отстраняването на салмонелата. В това проучване ефективността на LAB, която отговаря на гореспоменатите условия при инхибиране и отстраняване на салмонела, е потвърдена за профилактика и лечение на салмонела с помощта на LAB.

При разследването на количеството прием на фураж, количеството в групата на SA рязко намаля. Този резултат съвпадна с този в предишното проучване (19). В случая на LAB живите и hk бактериални групи намаляването на количеството на приема на фураж е слабо, като остава почти на същото ниво като това на нормалната група. Според изследването на Wang et al. през 1993 г. (20), количеството на приема на вода след приложение на салмонела се е увеличило поради ефектите на ендотоксините на салмонела (20). В това проучване всеки плъх от SA група приема 39,3 ml вода, докато всеки плъх от група Salmonella и hk (10 10) LAB приема 32,6 ml, което потвърждава, че количеството на приема на вода след инфекция със Salmonella се нормализира. Този резултат показва, че бактериите LAB hk са отстранили салмонелата и почти страничните продукти от салмонела поради свойствата на коагрегация, така че увеличаването на количеството на приема на вода е компрометирано.

Най-забележителният резултат от това проучване е разликата в броя на живите бактерии Salmonella във фекалиите на живите и hk LAB групи. В предишните проучвания растежът на салмонела в условията на киселинен стрес на млечната киселина беше инхибиран (21). В това проучване фекалните живи бактерии Salmonella в групата за лечение на живи бактерии LAB бяха по-значително инхибирани, отколкото в групата SA. Това може да е свързано с L. acidophilus, който е използван в това проучване, произвежда млечна киселина за промяна на чревното рН и за инхибиране на пролиферацията на салмонела. В резултат на наблюдението на промяната в броя на фекалните живи бактерии Salmonella в групата за лечение на бактерии LAB hk, голямо количество Salmonella оцелява във фекалиите. Счита се, че салмонелите, останали в червата, са били екскретирани поради агрегацията на hk LAB. Както бе споменато, резистентността към антибиотици при лечение на салмонела и ендотоксините на салмонела се счита за преодоляна.

За да се изследва нивото на възпаление при плъховете след приложението на салмонела, се сравняват техните серумни нива на TNF-алфа. Нивото на TNF-алфа в групата LAB живи и hk бактерии по-значително намалява от това в групата SA. Особено, в 10 10 LAB групата на живо и hk показа спад в нивото от 10 9 LAB групата. Според предишното проучване на клиничното изпитване, използващо Lactobacillus GG, приложението на LAB спомага за подобряване на експресията на рецепторите, които участват в имунологичното усилване (22). Смяташе се, че LAB, приложени на животински модели, са допринесли за имунологичното подобряване на червата и за инхибиране на повишаването на нивото на възпалителния цитокин TNF-алфа в случай на инфекция със салмонела. Следователно живите бактерии се считат за по-тясно свързани с чревната имунна система, отколкото hk бактериите.

В обобщение, когато LAB живите и hk бактериите бяха сравнени по отношение на тяхната профилактика на заразяване със салмонела, беше потвърдено, че групата на живите бактерии от групата LAB 10 9 се е отличила в контрола на нивото на експресия на серумния TNF-alpha IL-1beta, които са известни като представителен възпалителен цитокин; а в групата LAB 10 10 нивата на живите и hk бактерии са сходни. Това се дължи на временното нарастване на имунологичното подобрение след приложението на LAB живи бактерии; и когато се прилага повече LAB, настъпва подобно имунологично подобрение. В предишното проучване се съобщава, че ендотоксините на салмонела са предизвикали жажда при плъховете (20). Следователно групата салмонела, за която се очаква да има най-много ендотоксини на салмонела, отчита най-голямо количество прием на вода, докато групата салмонела и LAB показват намалено количество. Като се има предвид значителното намаляване на приема на вода, особено в hk LAB групата, намалената жажда, причинена от LPS, е по-ефективна в LAB hk бактериалната група.