Affiliation Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Кордоба, Испания

хляб

Affiliation Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Кордоба, Испания

Affiliation Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos, CSIC, Валенсия, Испания

Партньорски департамент по микробиология и паразитология, Факултет де Фармация, Университет на Севиля, Севиля, Испания

Партньорски департамент по микробиология и паразитология, Факултет де Фармация, Университет на Севиля, Севиля, Испания

Партньорски департамент по микробиология и паразитология, Факултет де Фармация, Университет на Севиля, Севиля, Испания

Affiliation Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos, CSIC, Валенсия, Испания

Affiliation Instituto de Agricultura Sostenible, CSIC, Кордоба, Испания

  • Хавиер Гил-Хуманес,
  • Фернандо Пистон,
  • Росана Алтамирано-Фортул,
  • Ана Реал,
  • Изабел Комино,
  • Каролина Соуза,
  • Кристина М. Росел,
  • Франсиско Баро

Фигури

Резюме

Цитат: Gil-Humanes J, Pistón F, Altamirano-Fortoul R, Real A, Comino I, Sousa C, et al. (2014) Пшеничен хляб с намален глиадин: алтернатива на безглутеновата диета за потребители, страдащи от патологии, свързани с глутен. PLoS ONE 9 (3): e90898. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0090898

Редактор: Карол Сестак, Университет Тулейн, Съединени американски щати

Получено: 20 октомври 2013 г .; Прието: 6 февруари 2014 г .; Публикувано: 12 март 2014 г.

Финансиране: Испанското министерство на икономиката и конкурентоспособността (проект AGL2010-19643-C02-02), Европейският фонд за регионално развитие (FEDER) и Хунта де Андалусия (проект P09AGR-4783) подкрепиха тази работа. Авторите също така признават финансовата подкрепа на Generalitat Valenciana (Project Prometeo 2012/064). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Материали и методи

Не са необходими разрешителни за описаното проучване, което отговаря на всички съответни разпоредби.

Растителен материал

Четири трансгенни линии с редуциран глиадин от Triticum aestivum cv. Bobwhite 208 (‘BW208’) и три трансгенни линии с редуциран глиадин на T. aestivum cv. Bobwhite 2003 („BW2003“) и съответните им линии от див тип бяха анализирани с помощта на рандомизиран пълен блок дизайн с две повторения. И двата диви вида са сортове пролетна пшеница, получени от CIMMYT от кръста CM 33203 с родословието Aurora // Kalyan/Bluebird/3/Woodpecker. Cultivar BW2003 е избран за неговата висока ефективност на трансформация и носи транслокацията T1BL.1RS от ръж. От друга страна, BW208 произлиза от линията SH 98 26 ‘Bobwhite’, описана като силно трансформируема от Pellegrineschi et al. [39] и не съдържа транслокация на ръж. В настоящото проучване BW208 и BW2003 показват общо съдържание на протеин от 11,6% и 10,5% от сухото тегло, съответно. Общото съдържание на глутеинов протеин (глиадини плюс глутенини) е било около 8,7% и 7,9% от сухото тегло, съответно за BW208 и BW2003.

Всички трансгенни редуцирани глиадинови линии са докладвани по-рано в [25] и съдържат инвертирания повторен (IR) фрагмент ω/α (вектори pGhp-ω/α и/или pDhp-ω/α), предназначени да регулират надолу всички групи на глиадини от RNAi. Трансгенните линии се самоопрашват в продължение на 4-5 поколения и показват нормални фенотипове в сравнение със съответните им диви видове.

Фрезоване на зърно

Бяло брашно се получава от всяко от двете независими повторения на линиите с редуциран глиадин и див тип. Зърната се хидратират до 16,5% влажност чрез добавяне на дестилирана вода на два етапа (24 часа и 20 часа преди смилането) с непрекъснато разклащане. Хидратираните семена (1 кг) от всяка линия се смилат поотделно на две стъпки в CD1 Chopin (Chopin Technologies, Villeneuve-la-Garenne Cedex, Франция) стандартизирана тестова мелница. В първата стъпка бяха получени бяло брашно и пълнозърнесто брашно. Пълнозърнестото брашно се презарежда във втори етап на смилане и полученото бяло брашно се смесва с полученото преди това, което води до общ добив от около 60%. Брашното се съхранява при стайна температура (RT) за една седмица. Търговско оризово брашно, доставено от Harinera Derivats del Blat de Moro, S.L. (Parets del Vallés, Испания) се използва за приготвяне на безглутенов хляб за контрол.

Хляб за печене

Тестото се приготвя на база тегло на брашно: за 300 g брашно се добавят 180 ml вода (225 ml вода за оризовото брашно), 3,6 g хлебна мая (Saf-Instant, Lesaffre, Франция) и 4,8 g трапезна сол. Съставките се смесват във Farinograph (Brabender GmbH & Co. KG, Германия) в продължение на 4 минути и почиват в продължение на 10 минути с покритие от пластмасов филм, за да се избегне изсъхване. Тестото се разделя ръчно (50 g) и парчетата тесто се валцуват механично в топъл хомогенизатор (Brabender GmbH & Co. KG, Германия). Парчетата тесто се поставят върху алуминиеви тави и ферментират в продължение на 45 минути при 30 ° C. Парчетата тесто се пекат в електрическа конвекционна фурна (Eurofours, Gommegnies, Франция). Процесът на печене се извършва при фиксирана температура на фурната от 180 ° C в продължение на 16 минути с 2 първоначални инжекции с пара по 10 секунди всяка. След изпичане питките за хляб се почиваха в продължение на 30 минути при RT, за да се охладят.

Характеристика на хляба

Теглото и обемът на хляба се определят в три хляба от всяка проба. Обемът на хляба се определя по метода на изместване на рапицата [40]. Съдържанието на влага в хлябовете се определя по метода на ICC № 110/1 [41], със стъпка на предварително кондициониране на пробите хляб. Три хляба от всяка проба и техните медиални резени бяха сканирани (HP Scanjet 4400C, Hewlett-Packard, САЩ) и бяха определени височина и ширина, за да се изчисли впоследствие съотношението ширина/височина. Цветът на кората и трохите се определя от колориметър Chroma Meter CR-400 (Konica Minolta Sensing Inc., Япония) и се изразява в CIE-L * a * b * цветова скала (CIE-Lab). Цветното пространство на CIE-Lab се състои от три перпендикулярни оси: L *, a * и b *. Тези три координати показват светлината на цвета (L *; където L = 100 означава бял цвят и L = 0 черен цвят) и неговата позиция между зелено и червено (a *; където отрицателните стойности означават зелено, а положителните стойности показват червено), и между синьо и жълто (b *; където отрицателните стойности показват синьо, а положителните стойности показват жълто). Направени са две независими измервания на всеки от трите питки, за да се определи кората и цвета на трохите.

Описателен сензорен анализ

Панел от 11 обучени оценители беше избран за оценка на пробите хляб (n = 20; 10 проби с две повторения), съответстващи на брашното с пшенично брашно с намален глиадин и див тип, и оризовото брашно. Обхватът на опита на участниците в тестовия панел за участие в описателен анализ и оценка на мащаба на широка гама от хлебни изделия варира от 3 до 20 години. Всички лица, съставляващи панела, дадоха своето информирано съгласие. Панелът оцени външния вид, аромата, вкуса и цялостното приемане на всяка проба при сляпа дегустация. За оценка, набор от шест проби беше представен на филийки (с дебелина 1 см) върху пластмасови съдове, кодирани и поднесени в произволен ред. Освен това оценителите бяха снабдени с минерална вода, за да прочистят небцето си между дегустациите. Всеки оценител получи списък със сензорни атрибути и техните дефиниции, за да ги насочва по време на оценката на пробата.

Характеристика на профила на аминокиселини

Пълнозърнестото брашно е използвано за характеризиране на аминокиселинния профил на линиите с редуциран глиадин и див тип. Пробите от брашно се хидролизират с използване на 6 N хлорна киселина и фенол и след това се дериватизират и анализират. За дериватизацията използвахме AccQ Fluor Reagent Kit (Waters). Първо, 20 µl от хидролизираната проба се смесват с 60 µl буферен разтвор (0,2 М боратен буфер) и след това се добавят 20 µl реагент за дериватизация (2 mg/ml 6-аминохинолил-N-хидросисукцинимидил карбамат, AQC) инструкциите на производителя. След 10 минути при 50 ° С разтворът се инжектира директно в тандемната спектрометрия с течна хроматография с висока ефективност (HPLC-MS/MS) (Varian 320-MS). Разделянето на аминокиселините се провежда като се използва 2,5 mM амониев ацетат (рН = 5,75) като разтворител А и разтвор от 2,5 mM амониев ацетат (рН = 6) и ацетонитрил (30∶70, амониев ацетат: ацетронитрил) като разтворител В. Колоната Pursuit XRs Ultra 2.8 C18 100 × 2.0 mm (Agilent) се използва като стационарна фаза и дебитът е 200 µl/min. Детекцията се извършва чрез масспектрометрия (MS) с електроспрей йонизационен режим (ESI) (положителен и отрицателен). Количеството аминокиселина се изразява като процент от общото тегло на пробата.

Сканираща електронна микроскопия (SEM)

Пробите (тесто и хляб) бяха замразени и изсушени и след това натрошени ръчно с помощта на върха на бръснач и покрити със злато. За наблюдение на пробите при 15 kV при RT е използван сканиращ електронен микроскоп JEOL JSM6300 (JEOL, Токио, Япония). SEM снимки с увеличение 1000x и 3000x бяха направени на новооткритата повърхност на всяка проба. Бяха анализирани проби от редове D894 (намалено съдържание на глиадин), E82 (намалено съдържание на глиадин и ниско молекулно тегло (LMW) глутенин) и див тип BW208.

G12 Състезателен ELISA

Статистически анализ

Данните бяха анализирани със статистическия софтуер R версия 2.12.1 [42] с помощта на графичния потребителски интерфейс (GUI) R Commander. Основните предположения за дисперсионния анализ (ANOVA) бяха потвърдени от теста на Shapiro-Wilk за нормално разпределение (функция „shapiro.test“, статистика на пакета), от теста на Levene за хомодедастичност (функция „leveneTest“, пакетна кола) и на Ramsey's тест за грешка в спецификацията на регресионното уравнение (RESET) за линейност („нулиране на теста“; пакет lmtest) и променливите се трансформират, ако е необходимо. Статистическият анализ между различните редове е извършен с помощта на модела за анализ на дисперсията (ANOVA) „Променлива ∼ Линия + Блок“ (функция „aov“, пакетни земеделски продукти), последван от Честно значимата разлика на Тюки (HSD) post hoc all- тест за двойно сравнение (функция „HSD.test“, пакетни земеделски продукти). Във всички статистически анализи Р стойности под 0,05 се считат за значими.

Разликите в съдържанието на аминокиселини между контролната и нискоглутеновата линия бяха оценени с помощта на модела ANOVA ‘Variable ∼ Block + Line’ с функцията ‘lm’ (статистика на опаковката). Средните сравнения бяха извършени чрез post hoc тест за многократно сравнение на Dunnett (функция ‘glht’, пакет multcomp). Графиката на кутията и мустаците е начертана с функцията ‘boxplot’ (пакетна графика).

Резултати и дискусия

Физическа характеристика на хляба с редуциран глиадин