Резюме

GH е ключов регулатор на постнаталния соматичен растеж и важен метаболитен хормон (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). На клетъчно ниво действията на GH се медиират чрез неговия специфичен GH рецептор (GHR), цитокинов рецептор от клас I (4, 5). По този начин способността на GH да упражнява своите биологични ефекти е тясно свързана с адекватни количества и нормално функциониране на неговия рецептор в прицелните тъкани.

растежен

Експресията на GHR се контролира строго на три нива: транскрипция, транслация и посттранслация (8). Въпреки че нашето разбиране за неговата транслационна и посттранслационна регулация е напреднало значително през последните две десетилетия (8, 9), знанията ни за нейната транскрипционна регулация остават относително ограничени. Изследвания на механизмите, модулиращи транскрипцията на GHR гени при хора и няколко животински видове, разкриват обща характеристика: използването на алтернативни 5'-некодиращи екзони, което води до генериране на множество транскрипти на иРНК, които се различават в своята 5'-нетранслирана област (5 ' -UTR) последователности, но се сливат в едно и също място в екзон 2 нагоре от транслационното начално място и по този начин кодират същия GHR протеин. Смята се, че тази 5'-UTR хетерогенност осигурява сложен регулаторен механизъм за определяне на специфични за развитието и тъканите, както и повсеместна експресия на GHR в различни целеви тъкани (10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ).

В настоящото проучване изследвахме няколко от тези предполагаеми cis-регулаторни елементи в проксималния промотор и екзон на V2, за да определим кои са функционално значими. Използвайки преходни анализи на трансфекция, промяна на гел и имунопреципитация на хроматин, демонстрирахме, че съществуват както положителни [Ets1, C/EBP-хомоложен протеин (CHOP), C/EBP], така и отрицателни (Hes1) регулаторни елементи, модулиращи транскрипция на V2, чрез директно свързване или косвено свързване на техните специфични транскрипционни фактори. Тези регулаторни фактори вероятно служат като ядрени медиатори, регулиращи експресията на hGHR в отговор на няколко различни извънклетъчни и вътреклетъчни сигнала.

Резултати

Ets1 директно активира промотора hGHR V2

Фамилията Ets на транскрипционни фактори играе важна роля в регулирането на генната експресия в отговор на множество сигнали за развитие, митогенни и туморни. Членовете на Ets се характеризират със своя силно консервиран ДНК свързващ (ETS) домейн, чрез който разпознават основния ДНК мотив, GGA (A/T) (20, 21). В проксималния промотор на hGHR V2 бяха открити две припокриващи се предполагаеми последователности на свързване на Ets (Фигури 1 и 2А). Въпреки че и двата сайта са силно запазени при различни видове (фиг. 1), досега не са докладвани проучвания за Ets регулация на експресията на GHR mRNA.

За да се определи дали Ets1 действа през предполагаемото му място (места) на свързване, Ets1 беше котрансфектиран с четирите Ets мутантни промоторни конструкции (Фиг. 2С). Мутациите на Ets мястото на свързване доведоха до значително намаляване (∼60%, P d - (+) - глюкоза (61). Ограничение на аминокиселините, поради дефицит на една или повече от основните аминокиселини или недостатъчен прием на протеин, може транскрипционно да активира експресията на CHOP (69, 70, 71). Тъй като hGH има толкова важни ефекти върху метаболизма на глюкозата и протеините, логично е експресията на hGHR ген да бъде регулирана в отговор на промените в състоянието на хранителните вещества. Нашите проучвания показват, че CHOP е вероятен вътреклетъчен медиатор на тези сигнали.

Няколко проучвания от лабораторията Lobie (65, 66, 72) демонстрират, че hGH, особено автокринният hGH, работещ чрез hGHR, може да регулира експресията на CHOP в клетките на карцинома на млечната жлеза и да повиши транскрипционната му активност по p38 MAPK-зависим начин, което води до засилена защита от апоптоза. Въз основа на нашата констатация, че CHOP може да регулира по-горе транскрипцията на hGHR, ние предполагаме, че се създава положителна обратна връзка; производството на автокринни hGH повишава нивата на CHOP и транскрипционното активиране, включително регулиране на експресията на hGHR ген, а повишените нива на hGHR ще доведат до повишен клетъчен отговор на автокринния hGH.

Колективно, нашите данни, показващи, че CHOP може да регулира активността на V2 промотора, осигуряват транскрипционна връзка за регулиране на експресията на hGHR V2 чрез ER стрес, хранителен статус и hGH.

C/EBPβ

Висока доза C/EBPβ стимулира V2 проксималния промотор. Най-вероятно е, когато е свръхекспресиран на това ниво, C/EBPβ действа като хомодимер. Въпреки че не се предвиждат консенсусни C/EBP свързващи последователности в V2 проксималния промоторен регион, нашите насочени към сайта експерименти за мутагенеза предполагат, че C/EBPβ хомодимерите използват поне отчасти неканоничния CHOP-C/EBP хетеродимерен сайт за активиране. Всъщност е доказано, че хомодимерите C/EBPβ свързват CHOP-C/EBP хетеродимерни сайтове, но с нисък афинитет (23, 33, 34). Нашата констатация, че C/EBPβ трансактивира V2 транскрипция само когато е изразена на високо ниво, е в съгласие с този сценарий.

Няколко проучвания съобщават, че C/EBPβ е критичен медиатор на GH-регулираната генна транскрипция (27, 28, 29, 73, 74, 75). GH и други хормони могат да фосфорилират C/EBPβ чрез MAPK или фосфатидилинозитол 3-киназни сигнални пътища и да насърчават трансактивационната му способност. Настоящото ни откритие, че C/EBPβ може да стимулира активността на V2 промотора, осигурява механизъм, чрез който hGH може да регулира експресията на собствения си рецептор. С изключение на Адамс (76), който също отбелязва, че членовете на C/EBP, по-специално C/EBPδ, могат да стимулират овчия 1В промотор, не са докладвани други проучвания на C/EBP на V2 хомоложни промотори. Тъй като обаче C/EBP протеините регулират различни физиологични процеси, включително клетъчна пролиферация, диференциация на адипоцитите, енергиен метаболизъм и възпаление (77, 78), не е изненадващо, че членовете на C/EBP допринасят за транскрипционното активиране на hGHR V2.

Hes1 упражнява репресивни ефекти върху V2 транскрипция

Hes1 е транскрипционен фактор на бозайници с основна спирала-спирала (bHLH), който действа като транскрипционен репресор чрез свързване към два специфични типа ДНК последователности: N кутията (CACNAG) или клас C тип Е кутия (CACGCG) (36, 38, 79, 80, 81). В настоящото проучване ние идентифицирахме и охарактеризирахме две подобни на клас С места Hes в рамките на екзона V2. Функционалният анализ и in vitro, както и in vivo тестовете за свързване показват, че свръхекспресията на Hes1 предизвиква мощна транскрипционна репресия на hGHR V2 промотора както в HEK293 клетки, така и в SGBS преадипоцити чрез свързване с тези екзонови Hes места. Тъй като и двата сайта са уникални за човешкия V2, той осигурява механизъм за специфична за видовете регулация на hGHR V2.

Hes1 е идентифициран като основна цел надолу по веригата на Notch сигнализация, еволюционно запазен механизъм, контролиращ решенията на съдбата на клетките (82); активирането на рецептора Notch индуцира експресията на Hes1 и други протеини от семейство Hes (79, 82, 83, 84, 85). Няколко скорошни доклада показват, че някои алтернативни сигнални каскади, като c-Jun N-терминален киназен път (86) или Ras/MAPK сигнализация (87), също могат да индуцират експресия на Hes1. По този начин, сигналите за развитие и различни други стимули могат да действат чрез Notch-зависими или независими пътища, за да индуцират Hes1, който впоследствие потиска целевата генна транскрипция. Въпреки че Hes1 е от съществено значение за няколко процеса на развитие, идентифицирани са малко целеви гени, особено при хората (38). Настоящият ни доклад е първото доказателство, че транскрипцията на hGHR V2 се регулира отрицателно от Hes1. Регулирането от Hes1 може да помогне да се обяснят промените в експресията на hGHR по време на развитието или диференциацията, но дали hGHR генът е цел на сигналния път на Notch през Hes1 трябва да бъде допълнително проучен.

Влияние на различни транскрипционни фактори върху повишаването на експресията на hGHR V2 по време на диференциацията на адипоцитите на SGBS

Неотдавнашната ни констатация, че V2 промоторът проявява по-висока активност в зрелите адипоцити, отколкото в преадипоцитите, предполага, че увеличаването на експресията на hGHR V2 по време на диференциацията на адипоцитите на SGBS се дължи поне отчасти на засилената транскрипционна активност (19). За да характеризираме специфичните фактори, които могат да участват в този процес, сравнихме експресията и функцията на няколко транскрипционни фактора в преадипоцитите и по време на диференциацията на адипоцитите.

Въпреки че установихме, че свръхекспресията на Ets1 или CHOP значително регулира активността на V2 промотора, нашите количествени RT-PCR данни показват, че нивата на експресия на Ets1 и CHOP са най-високи в сливните преадипоцити на SGBS, последвано от значително намаляване през началния етап на диференциация и ниско нива в по-късни етапи (допълнителна фиг. 2В). Липсата на корелация между експресията на Ets1 или CHOP и транскрипцията на V2 предполага, че нито един от факторите не е отговорен за повишаване на активността на V2 промотор по време на диференциацията на адипоцитите на SGBS. Не можем обаче да изключим възможността или Ets1, или CHOP да функционират на етапа на преадипоцитите, за да подготвят клетките за повишена експресия и диференциация на hGHR V2.

В обобщение установихме, че множество транскрипционни фактори действат върху hGHR V2 промотора, предизвиквайки положителни (Ets1, CHOP и C/EBPβ) и отрицателни (Hes1) ефекти. Те могат да служат като ядрени ефектори надолу по веригата, свързващи специфично регулиране на hGHR генната експресия в отговор на различни сигнални каскади, предизвикани от растежни фактори, развитие, хранене и стресови стимули (Фиг. 7).

Материали и методи

V2 промотор луцифераза репортер ген плазмиди и експресионни плазмиди

Използваните в настоящата работа луциферазни сливащи плазмиди са конструирани, както е описано по-горе (19). В нашето предишно (19), както и в настоящото проучване, ние избрахме да обозначим 1S основния TSS (T) на овцете като +1 за нашата нумерация на конструкцията на V2 промотор, тъй като тя представлява най-отдалечения cDNA 5'-край, идентифициран сред хомоложните V2-подобни преписи. Цис-елементите в плазмидите са мутирали с помощта на QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA), както е описано по-рано (19) (допълнителна таблица 1). Всички мутационни конструкции бяха потвърдени чрез ДНК секвениране.

Еукариотният Ets1 експресионен плазмид pEVRF-Ets1 и неговият контролен плазмид pEVRFO са предоставени от д-р S. A. Rabbani (McGill University) (95). Експресионният вектор на човешки CHOP pcDNA3.1-hygro-CHOP е получен от д-р К. Оназаки (Nagoya City University, Nagoya, Япония) (96), докато pCMV-C/EBPβ векторът на плъх е от д-р E. Holthuizen ( Университет в Урехт, Утрехт, Холандия) (97, 98). Експресионният плазмид Hes1 pCMV2-Hes1 и неговият контролен плазмид са предоставени от д-р S. Stifani (McGill University) (99).

Клетъчна култура, преходни трансфекции и тестове за луцифераза и β-галактозидаза

HEK293 (човешки ембрионален бъбрек), COS-1 и CV-1 (африканска зелена маймуна бъбреци) клетки са получени от Американската колекция от типови култури (Bethesda, MD) и се поддържат в DMEM, допълнена с 10% фетален говежди серум и антибиотици. Човешките SGBS преадипоцити, получени от стромалната клетъчна фракция на sc мастната тъкан от бебе с синдром на Simpson-Golabi-Behmel (SGBS) (22), бяха култивирани и диференцирани в зрели адипоцити, както беше описано по-рано (22). Всички клетки бяха инкубирани при 37 ° С в 5% СО2 във въздуха.

Преходни трансфекции на клетъчни линии HEK293, COS-1 и CV-1 бяха извършени с помощта на трансфектиращ реагент Polyfect (QIAGEN, Мисисауга, Онтарио, Канада), съгласно инструкциите на производителя. Накратко, клетките се посяват в шест или 12-ямкови плаки за тъканна култура и се отглеждат в пълна среда за 16–20 h, за да достигнат 60–80% сливане по време на трансфекцията. Клетките бяха трансфектирани с ДНК смес, включваща V2 промотор луциферазни репортерни конструкции (0,5 μg), β-галактозидазен контролен плазмид (0,04–0,2 μg) и експресионни вектори (за Ets1, CHOP, C/EBPβ или Hes1) или съответните им празни вектори заедно с реагент Polyfect в съотношение 1: 3. Трансфекциите се извършват в три екземпляра и празният pGL3-базичен вектор се използва като отрицателна контрола. За човешките преадипоцити на SGBS също се извършва трансфекция, използвайки метода Polyfect, с изключение на това, че количеството на репортерната конструкция е увеличено до 1 μg за максимална луциферазна активност.

На 48 часа след трансфекцията клетките бяха събрани в 200 μl 1 × буфер за пасивен лизис (Promega, Madison, WI) и лизатната супернатанта беше количествено определена за луциферазна и β-галактозидазна активност (Tropix, ABI, Bedford, MA) с помощта на EG&G Berthold (Oakville, TN) биолунометър Microlumat Plus (LB 96V). Стойностите на луциферазата бяха нормализирани до стойностите на β-галактозидаза, вътрешен контрол за ефективност на трансфекция, и изразени като кратно активиране, както е посочено на фигурите и легендите.

EMSA

Ядрените протеини от клетки HEK293 или клетки HEK293, свръхекспресиращи или Ets1, или Hes1, бяха извлечени с помощта на NE-PER комплект за ядрена и цитоплазмена екстракция (Pierce, Rockford, IL), както е описано по-горе (19). Ядреният екстракт от клетка Jurkat е закупен от Santa Cruz Biotechnology (Санта Круз, Калифорния).

Комплементарни 20- до 35-мерни олигонуклеотиди, съдържащи или свързващата последователност на Ets, или последователността на Hes1 на място 1 (допълнителна таблица 1) бяха синтезирани, отгрявани, за да се образуват двуверижни ДНК сонди, маркирани с γ- 32 Р и Т4 полинуклеотид киназа, и почистени чрез преминаване през G-50 въртящи се колони (Amersham, Piscataway, NJ). Белязаните сонди (50 fmol; ~ 50 000 cpm) се инкубират с 5-10 μg ядрени екстракти при стайна температура за 30 минути. За анализи на конкуренцията, 100- до 200-кратен моларен излишък на немаркирани сонди се съчетава с ядрените екстракти преди добавянето на маркирана сонда. При експерименти с преместване, 2 μg анти-Ets1 поликлонални антитела (sc-111; Santa Cruz Biotechnology) се добавят към реакционната смес и се инкубират при 4 ° С в продължение на 1 час преди добавянето на маркирани сонди. ДНК-протеиновите комплекси се анализират чрез електрофореза върху неденатуриращи 5% полиакриламидни гелове, работещи при постоянни 100 V за около 1 h в 0,5 х Tris-borate-EDTA (TBE) буфер. Геловете бяха изсушени и изложени на филм Kodak Biomax-MR (Kodak, Рочестър, Ню Йорк).

CHIP анализ

Количествена RT-PCR в реално време

Статистически анализ

Данните са изразени като средно ± se. Значимостта на наблюдаваните разлики между групите е определена чрез еднопосочен ANOVA, последван от тест за множествено сравнение на Tukey (P> AF322014), съдържащ 211 bp от 5'-нагоре по веригата промотор и около 300 bp от V2 екзон е подравнен с неговите хомолози, включително овце 1B (> S78252), говеда 1B (> AF046861) и мишка L2 (> AF120480). Идентичността на последователността се обозначава със звездички, докато тиретата показват пропуски, въведени за максимално подравняване. Основната TSS на овце 1B (T, получер) е обозначена със +1 със стрелка. Това също се използва като позиция +1 за номерирането на конструкцията на нашия човешки V2 промотор, защото представлява най-дългата V2-подобна cDNA, идентифицирана до момента. Мотивите на потенциалните места за свързване на транскрипционни фактори са подчертани и назовани. Силно консервираната кутия CCAAT и две припокриващи се места за свързване на Ets са в кутия. Специфичните за човека сайтове CHOP и Hes1 са маркирани съответно с пунктирана линия и кръгли точки. Посочени са Sp места, идентифицирани в проучвания 1B за овце и говеда (получер и курсив). Сайтовете SREBP (курсив) и ZBP-89 (стрелка) се припокриват със сайта exon Sp.