1 Laboratoire de Physiologie et Pharmacologie, Université Libre de Bruxelles, 1070 Bruxelles, Белгия

пероксид

2 Laboratoire d’Histologie, Histopathologie et Neuroanatomie, Université Libre de Bruxelles, 1070 Bruxelles, Белгия

Резюме

Бъбречните и белодробните епителни клетки са изложени на някои значителни концентрации на H2O2. В урината може да достигне 100 μM, докато в епителната лигавична течност в белия дроб се изчислява, че е в микромоларен до десеткимикромоларен диапазон. Водородният пероксид има стимулиращо действие върху едноканалната активност на епителните натриеви канали (ENaC). Той също така увеличава стабилността на канала при мембраната и забавя транскрипцията на ENaC субединиците. Експресията и активността на канала могат да бъдат инхибирани в някои други, вероятно по-високи, окислителни състояния на клетката. Този преглед обсъжда ролята и произхода на H2O2 в белия дроб и бъбреците. Обобщени са зависимите от концентрацията ефекти на водородния прекис върху ENaC и механизмите на неговото действие. Този преглед също така описва перспективите за бъдещи изследвания, свързващи оксидативния стрес, епителния натриев транспорт и белодробната и бъбречната функция.

1. Въведение

Общоприето е, че клетките в повечето тъкани са изложени на някакво ниво на H2O2 и локално това ниво може да достигне значително високи концентрации. Многобройни проучвания съобщават, че високи нива на H2O2 (обикновено> 100 μМ) са цитотоксични за широк спектър от животински, растителни и бактериални клетки в културата, въпреки че LD50 стойностите зависят от клетъчния тип, продължителността на експозицията и условията на клетъчната култура [1–5]. Поради това е широко разпространено мнението, че H2O2 е много токсичен in vivo и трябва бързо да се елиминира. Парадоксално е обаче, че пациентите с акаталаземия (автозомно-рецесивно пероксизомно разстройство, причинено от пълна липса на каталаза, която неутрализира H2O2) рядко имат здравословни проблеми [1]. Избиването на глутатион пероксидаза, ензим, който също редуцира свободния водороден пероксид до вода, не индуцира особен фенотип [6, 7]. Това предполага, че водородният пероксид освен участието във вродения имунитет може да има и важна сигнална и/или регулаторна роля в живите организми [8].

Транспортът на йони от белодробните епителни клетки е основният механизъм, който поддържа оптимално ниво на лигавицата на дихателните пътища и алвеоларната течност. Това от своя страна определя ефективната аерация на белия дроб и улеснява дифузията на газове през алвеоларно-капилярните стени. В бъбреците реабсорбцията на натрий в различни части на нефрона регулира баланса на течностите и по този начин кръвното налягане. Следователно, вътреклетъчните сигнални каскади, които регулират йонния транспорт, медииран от йонните канали, са от особен интерес за всяко фундаментално и клинично изследване на белодробната и бъбречната функция. Ролята на реактивните кислородни видове [ROS] в модулацията на активността на йонните канали беше призната наскоро. Регулирането на йонните канали от тези реактивни видове може да се случи по няколко различни начина [9]. Първият начин е чрез директно окисляване на ключови аминокиселинни остатъци от протеините на канала. Второ, реактивните видове могат да променят активността на други сигнални механизми, които вторично водят до промени в активността на канала или експресията на генния канал. Най-накрая има по-сложни механизми, медиирани чрез промени в трафика или оборота на протеини на канали чрез промени в протеазомното разграждане на каналите (rew в [9]).

Целта на този преглед е да обясни ролята и произхода на H2O2 в белите дробове и бъбреците и зависимите от концентрацията му ефекти върху натриевия транспорт, особено върху епителния натриев канал (ENaC). Този преглед също така описва перспективите за бъдещи изследвания, свързващи оксидативния стрес, епителния натриев транспорт и белодробната и бъбречната функция.

2. Източници на H2O2 и оценка на На място Концентрация

2.1. Бял дроб

Реактивните кислородни видове (ROS) в белия дроб могат да имат екзогенен и ендогенен произход. Първо, ROS може да присъства във вдишвания въздух, който съдържа цигарен дим, замърсители на околната среда и окислителни газове. Алтернативно, хидропероксиди [напр. H2O2], супероксидни аниони и хидроксилни свободни радикали могат да бъдат генерирани от активирани възпалителни клетки [като неутрофили, еозинофили и алвеоларни макрофаги] и от самите епителни и ендотелни клетки [10]. Тези клетъчни ROS се образуват като междинни продукти на непълното редуциране на кислорода в митохондриалните електронно-транспортни системи, чрез микрозомен метаболизъм на ендогенни съединения и ксенобиотици, или от различни ензимни генератори, като ксантин оксидаза. Ендотелните, възпалителни клетки и пневмоцитите генерират и освобождават ROS чрез NADPH-зависим от оксидазата механизъм, който се медиира от активиране на мембранните рецептори на фосфолипаза С, което води до повишаване на вътреклетъчното ниво на калций [11]. И накрая, има убедителни данни, които предполагат, че водородният прекис, произведен в тънките черва, навлиза в мезентериалната лимфа и намира пътя си в белия дроб [12].

, невъзможно е да се екстраполират съществуващите данни за молните фракции в течна фаза до такава ниска стойност.

Алтернативен начин за оценка на абсолютната концентрация на H2O2 на място е да се измери концентрацията на пероксид в бронхоалвеоларна течност за промивка (BALF) и да се коригира стойността чрез коефициент, получен чрез техника за разреждане на урея [21]; досега обаче нито една изследователска група не го е направила. Въпреки това има публикувани доклади с отделни данни за концентрацията на водороден пероксид в BALF и за обема на течността на алвеоларната лигавица. В нормалните човешки бели дробове обемът на течността на алвеоларната лигавица се колебае в рамките на 0,2–2,0 ml [22–26], докато при плъхове е установено, че този обем е в границите на 0,03–0,26 ml [27–29]. Тъй като често използваният обем течност за бронхоалвеоларна промивка при хора е 100 ml и 5 ml при плъхове, очакваният фактор на разреждане вероятно ще бъде

100 в нормални бели дробове [30]. Знаейки, че концентрацията на H2O2 в BALF е 0,14–0,70 μМ при плъхове [31, 32] и 0,08 μМ при хората [33], действителни концентрации на водороден прекис в белите дробове на място може да се очаква добре в микромоларен до десеткимикромоларен диапазон. Това обаче са само приближения и те налагат допълнителни проучвания.

2.2. Бъбрек, пикочен канал и пикочен мехур

Прясно изпразнената човешка урина може да съдържа значителни количества H2O2, при концентрации, понякога надвишаващи 100 μМ [34–36]. Изглежда, че H2O2, открит в човешката урина, възниква, поне отчасти, от

2.3. Кръв

Водородният пероксид, наблюдаван в белия дроб и бъбреците, най-накрая може да намери пътя си от кръвта. Някои проучвания твърдят значителни нива на H2O2 (до

35 μМ) в човешката кръвна плазма [39–41]. Тези проучвания обаче са проведени при анализни условия, при които е предотвратено отстраняването на H2O2. Това предполага, че човешката плазма може непрекъснато да генерира H2O2. Един ензим, участващ в този процес, поне при патологични условия, изглежда е ксантиноксидаза [42]. В плазмата H2O2 може да реагира с хем протеини, аскорбат и протеин-SH групи и се разгражда от присъстващите следи от каталаза и по този начин, в условията на поддържане на нормални антиоксидантни механизми, нивата на H2O2 са много ниски, близо до нула [43].

3. Регулиране на натриевите канали чрез водороден прекис

Последните проучвания показват, че експресията и активността на ENaC могат да бъдат регулирани от окислителното състояние на клетката. Директно прилагане на 100 μM H2O2 до A6 дистални нефронови клетки повишават регулирането на ENaC отворена вероятност и еквивалентен трансепител натриев ток на отворена верига [44–47]. Освен това, фармакологичното инхибиране на NADPH оксидаза NOX-4 от фулвен-5 в A6 клетки понижава регулирането на ENaC активността [47]. По този начин това предполага, че тоничното производство на H2O2 от NOX-4 поддържа едноканална активност на ENaC. Подобен стимулиращ ефект на екзогенния H2O2 при 250 μМ е получено от Downs и колеги в белодробни епителни клетки [48]. Те показаха, че едноканалната активност както на силно селективни, така и на неселективни ENaCs е регулирана в пневмоцитите от тип 2 [48]. В нашите експерименти за образуване на епителни куполи върху непореста подложка, което е отражение на активността на ENaC [49], каталазата и супероксидният чистач TEMPO инхибира до 80% от дексаметазон-индуцираното образуване на купол в белодробните епителни клетки H441 и субмилимоларните концентрации на H2O2 могат сами временно стимулират това образуване на купол [нашите непубликувани данни].

Доказано е, че друг реактивен кислород, супероксидните аниони, произведени от NOX-2, регулира положително активността на ENaC в алвеоларните клетки [50]. Супероксидният анион може също да има непряко стимулиращо действие върху ENaC едноканална активност чрез неутрализиране на NO, което намалява ENaC активността [51]. В допълнение, агентите, които повишават локалната концентрация на супероксид (смес от хипоксантинови съединения и ксантиноксидаза) стимулират едноканална активност на ENaC в епителни клетки A6 [52].

На нивото на експресия на протеини е доказано, че екзогенният водороден пероксид инактивира убиквитинацията на белия дроб α-ENaC, като по този начин увеличава повърхностната си експресия [48]. Но на ниво генна експресия, контрастиращи ефекти на H2O2 върху α-, β-, и γ-Съобщава се за ENaC [48, 53, 54]. Докато ниските дози под 0,25 mM нямат значителен ефект върху транскрипцията [48], близо до милимоларни концентрации на H2O2 потискат α-ENaC транскрипция [53, 54]. При пневмоцити тип II цикличният AMP и активирането на глюкокортикоидни рецептори стимулират експресията и активността на ENaCs, както и експресията на H2O2, продуцирайки NADPH оксидаза DUOX1 [15, 55], което оставя възможност за спекулация, че дългосрочното активиране на единична -каналната активност на ENaC от сАМР и дексаметазон може да бъде отчасти свързана с производството на H2O2 от DUOX1.

Горното стимулиращо действие на водородния пероксид върху ENaC контрастира на докладите, получени при проучвания със силен оксидант стрес върху белодробните епителни клетки, в които е докладвано понижаване на регулирането на транспорта на натрий. При проучвания на еднослойни белодробни епителни клетки, силен оксидативен стрес, предизвикан от милимоларни концентрации на H2O2, променя механизмите за транспортиране на епителни йони чрез намаляване на тока на късо съединение (

) и еднослойна устойчивост (

), като същевременно е по-ефективен от базолатералната (серозалната) страна [61]. В това проучване ефективната концентрация на апикален H2O2, при която беше намалена с 50%, беше абсолютно нефизиологична и равна на 4 mM [61]. Съобщено е също, че екзогенният водороден прекис надвишава 200 μМ пречи на индуцираната от глюкокортикоиди транскрипция на α-ENaC субединица в белодробни епителни клетки A549, H441 и Calu-3 [53, 54].

Друг начин за създаване на състояние на тежък оксидативен стрес се състои в прилагането на значителна концентрация на глутатион дисулфид (GSSG). Zhang и колеги съобщават за наномоларни концентрации на GSSG в един милилитър среда, получена след лизис на

HL60 клетки [62]. За клетка от 10 μm в диаметър с клетъчен обем приблизително 0,5 pL, това съответства на 10 4 фактор на разреждане и по този начин могат да се очакват само микромоларни до десет микромоларни вътреклетъчни концентрации на GSSG в клетки в покой. Даунс и колеги са показали, че директно прилагане върху белодробни епителни клетки от 400 μM GSSG индуцирано намаляване на вероятността за отваряне на ENaC [63]. Тази концентрация на GSSG е поне десет пъти по-висока, отколкото в клетката в покой и ясно представлява състояние на тежък оксидативен стрес. Инхибиторният ефект на GSSG се обяснява с обратимото образуване на смесени дисулфиди между глутатион и ниско рКа цистеинилови остатъци на ENaC и евентуално с необратимо окисление на последния [63].

4. Перспективи и перспективи

Диетичните полифеноли от зелен чай и червена лоза са добре известни като средства за понижаване на кръвното налягане и много проучвания показват обратна връзка между диетичната консумация на тези полифеноли и намалената честота и смъртност от сърдечно-съдови заболявания [75–77]. Намаляването на маркерите на оксидативен стрес, индуциран от диетични полифеноли в различни животински модели на хипертония, може да бъде механизъм, участващ в ефекта на понижаване на кръвното налягане [78, 79]. Не може да се изключат директните бъбречни ефекти при антихипертензивното действие на полифенолите, тъй като например понижаването на регулацията на ENaC в бъбреците от флавоноид кверцетин допринася за ефекта на понижаване на кръвното налягане при чувствителната към сол хипертония на Dahl [80, 81].

ENaC също е основен играч, който участва в абсорбцията на течности в белия дроб. При муковисцидоза [CF] отсъствието на функционален трансмембранен регулаторен канал на муковисцидоза (CFTR) усилва регулирането на активността на канала ENaC и допълнително намалява секрецията на сол и вода чрез реабсорбиране на натриеви йони. От друга страна, белодробната болест на муковисцидозата се характеризира с хронично възпаление на дихателните пътища и по този начин оксидативен стрес, който може да бъде измерен количествено чрез измерване на водороден прекис в издишания кондензат на дъха [17, 82]. Тогава е правдоподобно, че повишеното производство на H2O2 в белите дробове на CF допринася за хиперабсорбцията на натрий. Това предложение заслужава проучване на връзката между тези две явления. В тази връзка е показано, че окислението, възникващо в резултат на възпаление на дихателните пътища или излагане на околната среда, допринася за патологичното образуване на слуз в белия дроб и такива антиоксиданти като полифенол ресвератрол и N-ацетил-цистеин имат явна муколитична активност [83, 84]. Също така би било интересно да се види ефектът от пулверизираната каталаза върху мукоцилиарния клирънс при здрави пациенти с CF или при животински модели, въпреки че може да компрометира вродения имунитет в белите дробове.

5. Заключение

Прегледът на литературата предполага, че водородният пероксид има стимулиращо действие върху едноканалната активност на ENaC и върху неговата стабилност в мембраната, като същевременно има възможно инхибиторно действие върху транскрипцията на субединиците ENaC. При условия на тежък оксидативен стрес на клетката тази активност на канала се инхибира. Модулирането на активността на ENaC от H2O2 може да допринесе за развитието на такива патофизиологични състояния като системна хипертония и удебеляване на слузта в белите дробове на CF, въпреки че досега не са предоставени преки доказателства в подкрепа на тези хипотези. Като заключителна бележка за перспективите, ние предлагаме, че по-нататъшните проучвания върху ENaCs могат да се фокусират върху действието на диетичните полифеноли върху активността и експресията на този канал в белодробните и бъбречните епителни клетки. Тези изследвания трябва да се извършват заедно с измерванията на окислителното състояние на тези клетки, включително на място измервания на абсолютни стойности на концентрации на водороден прекис.

Конкуриращи се интереси

Авторите заявяват, че нямат конкуриращи се интереси.

Благодарности

Авторите благодарят за финансовата подкрепа от „Фонд Алфонс и Джийн Фортън“, „Фонд Кравес“ и „Фондове за подобряване на търсенето“ на ULB.

Препратки