инхибира

Кореспонденция на: † Мичунг Юн. Катедра по биомедицинско инженерство, Университет Мокуон, Daejeon 35349, Корея.
Тел: + 82-42-829-7581, факс: + 82-42-829-7590, e-mail: [email protected]

* Аспирант, ** Бакалавър, *** Професор.
§ Тези автори са допринесли еднакво: Younghyun Park, Joonseong Jang.

Ключови думи: Аскорбинова киселина, хипергликемия, липогенеза, панкреас, висцерално затлъстяване

Висцералното затлъстяване е силно свързано с метаболитен синдром, който включва дислипидемия, хипертония, нарушен глюкозен толеранс и чернодробна стеатоза (Grundy, 2015). По-специално, висцералната адипоцитна хипертрофия е забележим определящ фактор за метаболитните заболявания и дисфункцията на мастната тъкан (Haller et al., 1979; Laforest et al., 2015). Хипертрофичните адипоцити произвеждат и секретират няколко адипокини (напр. Туморен фактор некроза α, лептин и резистин) и свободни мастни киселини, които са замесени в развитието на диабет тип 2 (T2D) и инсулинова резистентност (Okuno et al., 1998; Jeong and Yoon, 2009; Koleva et al., 2013).

Витамин С, известен още като аскорбинова киселина и L-аскорбинова киселина, е обратно свързан със затлъстяването. Концентрациите на витамин С в плазмата са значително по-ниски при лица със затлъстяване, отколкото при слаби индивиди (Johnston et al., 2007; da Silva et al., 2012), а по-ниските нива на витамин С в плазмата предизвикват увеличаване на телесното тегло и висока обиколка на талията (Canoy et al ., 2005; Johnston, 2005; Johnston et al., 2006; da Silva et al., 2012). Обратно, приемът на витамин С насърчава загубата на тегло и инхибира централното затлъстяване при мъже и жени с наднормено тегло и затлъстяване (Naylor et al., 1985; da Silva et al., 2012; Garcia-Diaz et al., 2014). По същия начин добавките с витамин С предпазват от затлъстяване и затлъстяване при животински модели на затлъстяване, като плъхове, хранени с диети или овариектомизирани (Campion et al., 2006; Kim et al., 2018). Витамин С също намалява гликирането на инсулина, без да влияе върху телесното тегло при ob/ob мишки, и предотвратява чернодробната стеатоза при диети, хранени с холин, с дефицит на холин (Abdel-Wahab et al., 2002; Oliveria et al., 2003).

Храненето с високо съдържание на мазнини (HFD) при мишки C57BL/6J предизвиква затлъстяване и метаболитен синдром (Winzell и Ahren, 2004; Fraulob et al., 2010). Тези животни са известни със своя видимо нарушен глюкозен толеранс, инсулинова резистентност и недостатъчна компенсаторна реакция на островчетата (Ahren and Pacini, 2002). Съответно, този индуциран от HFD модел на затлъстели мишки C57BL/6J се използва при проучвания на патофизиологията на нарушен глюкозен толеранс и T2D и при разработването на нови лечения (Winzell et al., 2003; Winzell and Ahren, 2004). Ние предположихме, че витамин С може да инхибира хипертрофия на висцералните адипоцити и непоносимост към глюкоза при индуцирани от HFD затлъстели мишки C57BL/6J. За да изследваме тази възможност, измерихме ефектите на витамин С при мишки C57BL/6J, хранени с HFD, върху висцералната мастна експресия на гени, участващи в липогенезата, и в резултат върху хипертрофията на висцералните адипоцити и нивата на кръвната захар.

Лечение на животни

Анализ на кръвта

Измервани са нивата на кръвната глюкоза с помощта на Accu-Chek Performa System (Roche, Базел, Швейцария) Проведени са тестове за толерантност към орална глюкоза (2 g/kg телесно тегло), като се определят нивата на кръвната глюкоза през посочените интервали от време.

Хистологичен анализ

Мезентериалните мастни тъкани се фиксират в 10% фосфатно буфериран формалин за 1 ден и се обработват за парафинови срези. За да се измери размерът на адипоцитите, срезовете на мастната тъкан (5 μm) се оцветяват с хематоксилин и еозин (H&E). За да се анализира морфологията на панкреатичните островчета, секциите на панкреаса се оцветяват с H&E. Оцветените препарати бяха изследвани с помощта на система за анализ на изображения (Media cybernetics, Bethesda, MD, USA).

Количествена верижна реакция на полимераза в реално време (PCR)

Общата клетъчна РНК от мезентериални мастни тъкани се приготвя, като се използва реактив Trizol (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA), съгласно инструкциите на производителя. Общата клетъчна РНК (2 μg) се транскрибира обратно, като се използва обратна транскриптаза на миши левкемия на Moloney, за да се генерира антисенс шаблон за cDNA. Интересните гени бяха амплифицирани от обратната транскрибирана кДНК, използвайки Accu Power® GreenStar ™ qPCR PreMix (Bioneer, Deajeon, Корея) на машина за количествено количествено термично блокче Excycler ™ 96 (Bioneer). PCR праймерите, използвани за анализи на генна експресия, са показани в допълнителна таблица 1. PCR се извършва при следните условия: денатуриране при 95 ° C за 5 минути, последвано от 45 цикъла от 95 ° C за 10 s, 60 ° C за 40 s и 72 ° С за 10 s. Концентрациите на транскрипт се изчисляват като копия на μL, като се използва стандартна крива, а относителните нива на експресия се изчисляват като отношение на целевата генна кДНК към β-актинова кДНК.

Последователности от праймери, използвани за количествени PCR анализи в реално време

Гени Банки с генетични последователности
FAS NM_007988.3 Напред: 5’- GCCCTCCCGTACACTCTCTC -3 ’
Реверс: 5’- CTTGGGTGCTGACTACAACC -3 ’
PPARy NM_001308354.1 Напред: 5’- ATTCTGGCCCACCAACTTCGG -3 ’
Реверс: 5’- TGGAAGCCTGATGCTTTATCCCCA -3 ’
SCD1 NM_009127.4 Напред: 5’- CGGAAATGAACGAGAGAAGG -3 ’
Реверс: 5’- CCGAAGAGGCAGGTGTAGAG -3 ’
SREBP-1c NM_001313979.1 Напред: 5’- CTTCTGGAGACATCGCAAAC -3 ’
Реверс: 5’- GGTAGACAACAGCCGCATC -3 ’
β-актин NM_007393.5 Напред: 5’- TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAA -3 ’
Реверс: 5’- TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG -3 ’


Статистически анализ

Всички стойности са изразени като средно ± стандартно отклонение (SD). Групите бяха сравнени чрез дисперсионен анализ, последван от тест за множество сравнения на Tukey; P

Регулиране на телесното тегло и масата на мезентериалната мастна тъкан чрез витамин С

За да определим дали витамин С регулира висцералното затлъстяване при мишки с хранително затлъстяване, измерихме телесното тегло и висцералната мезентериална мастна тъкан при мишки C57BL/6J, хранени с LFD, HFD или HFD-VC за 15 седмици. След 15 седмично лечение, HFD мишките показаха 40% по-голямо телесно тегло, отколкото LFD мишките (Фиг. 1А). За разлика от това, HFD-VC мишките имат 13% по-ниско телесно тегло, отколкото HFD мишките. Масата на мезентериалната мастна тъкан е намалена значително чрез добавяне на витамин С при HFD мишки. Както е показано на фиг. 1В, масата на мезентериалните мастни накладки при HFD-VC мишките е намалена с 46% в сравнение с тази на HFD мишките.

Фиг. 1.

Телесно тегло и маса на мезентериалната мастна тъкан. Възрастни мъжки мишки C57BL/6J са хранени с диета с ниско съдържание на мазнини (LFD), диета с високо съдържание на мазнини (HFD) или HFD, допълнена с витамин С (HFD-VC) в продължение на 15 седмици. (A) Модулация на телесното тегло от витамин C. (B) Регулиране на мезентериалната маса на мазнините от витамин C. Всички стойности са изразени като средната стойност ± SD (n = 8 за група). # P P

Модулация на размера на висцералните адипоцити от витамин С

Фиг. 2.

Хистология на мезентериалните мастни тъкани. Възрастни мъжки мишки C57BL/6J са хранени с диета с ниско съдържание на мазнини (LFD), диета с високо съдържание на мазнини (HFD) или HFD, допълнена с витамин С (HFD-VC) в продължение на 15 седмици. (А) Хистологичен анализ на висцералната мастна тъкан. Представителни H & E оцветени висцерални мастни тъкани (оригинално увеличение × 100). (B) Анализ на размера на висцералните адипоцити. Измерен е размерът на адипоцитите във фиксирана зона (1 000 000 μm 2). Всички стойности са изразени като средната стойност ± SD (n = 8 на група). # P P

Модулация на свързаната с липогенезата генна експресия от витамин С

За да определим дали намаляването на теглото на мезентериалните мазнини и размера на адипоцитите, предизвикано от лечението с витамин С, е резултат от инхибиране на липогенезата, ние изследвахме ефектите на витамин С върху експресията на липогенни ензими и техните регулатори, включително синтаза на мастни киселини (FAS), стеароил- CoA десатураза 1 (SCD1), стерол регулаторен елемент, свързващ протеин 1c (SREBP-1c), и пероксизомен пролифераторактивиран рецептор γ (PPARγ). Нивата на иРНК на SCD1 и SREBP-1c са значително намалени съответно с 36% и 15% при HFD-VC мишки в сравнение с тези при HFD мишки (Фиг. 3).

Фиг. 3.

Висцерална мастна експресия на гени, участващи в липогенезата. Възрастни мъжки мишки C57BL/6J са хранени с диета с ниско съдържание на мазнини (LFD), диета с високо съдържание на мазнини (HFD) или HFD, допълнена с витамин С (HFDVC) в продължение на 15 седмици. Всички стойности са изразени като средна стойност ± SD (n = 8 на група). * Р

Регулиране на нивата на глюкозата в кръвта от витамин С

За да определим ефектите на витамин С върху метаболизма на глюкозата, ние измерихме концентрациите на глюкоза на гладно в групи LFD, HFD и HFD-VC. HFD мишките имат 59% по-високи нива на глюкоза в кръвта от тези на LFD мишки (фиг. 4А), а лечението с витамин С намалява тези по-високи концентрации с 36%. По подобен начин, HFD-VC мишките имат значително подобрен глюкозен толеранс в сравнение с HFD-хранени затлъстели мишки. Третираните с витамин С мишки показват значително намаляване на нивата на кръвната глюкоза 30 минути след перорално приложение на глюкоза в сравнение с нелекувани мишки с HFD (фиг. 4В).

Фиг. 4.

Нива на кръвната захар и орален тест за глюкозен толеранс. Възрастни мъжки мишки C57BL/6J са хранени с диета с ниско съдържание на мазнини (LFD), диета с високо съдържание на мазнини (HFD) или HFD, допълнена с витамин С (HFD-VC) в продължение на 15 седмици. (A) Глюкоза на гладно и (B) орален тест за глюкозен толеранс. Всички стойности са изразени като средна стойност ± SD (n = 8 на група). # P P

Регулиране на хипертрофия на панкреатичните островчета от витамин С

Тъй като лечението с витамин С подобрява глюкозния толеранс, ние оценихме ефектите на витамин С върху морфологията на панкреатичните островчета, като оценихме H & E оцветени участъци от панкреатична тъкан. Както е показано на фиг. 5, панкреатичните островчета при HFD мишки са значително по-големи от тези при LFD мишки. Въпреки това, добавянето на витамин С към HFD мишки инхибира хипертрофията на островчетата, намалявайки размера на островчетата до нивото, наблюдавано при LFD мишки.

Фиг. 5.

Хистология на панкреатичните островчета. Възрастни мъжки мишки C57BL/6J са хранени с диета с ниско съдържание на мазнини (LFD), диета с високо съдържание на мазнини (HFD) или HFD, допълнена с витамин С (HFD-VC) в продължение на 15 седмици. Представителни H & E оцветени участъци от панкреатична тъкан (оригинално увеличение × 40).

Витамин С, водоразтворим витамин, намиращ се в храните и използван като хранителна добавка, има антиоксидантни и възстановяващи функциите тъкани и действа като кофактор за ензимния синтез на невротрансмитери, колаген и карнитин. Предполага се, че високите нива на прием на витамин С имат отрицателна корелация със затлъстяването при хора и животни, както и развитието на скорбут, рак и сърдечно-съдови заболявания (Campion et al., 2006; Johnston et al., 2007; Garcia-Diaz et ал., 2014). Тъй като предишното ни проучване показа, че витамин С регулира затлъстяването и неалкохолната мастна чернодробна болест при мишки C57BL/6J, хранени с HFD (в преса), предположихме, че витамин С може да регулира хипертрофия на висцералните адипоцити и нарушен глюкозен толеранс по време на затлъстяването.

В това проучване лечението на индуцирани от HFD затлъстели мишки C57BL/6J с големи количества витамин С в продължение на 15 седмици демонстрира, че витамин С значително намалява телесното тегло, висцералната мезентериална мастна маса и размера на мезентериалните адипоцити отчасти чрез намалената експресия на липогенни ензими и техните регулатори в мезентериалните мастни тъкани. В допълнение, витамин С понижава нивата на глюкоза на гладно и подобрява толерантността към глюкоза през устата, отчасти поради намаления размер на висцералните адипоцити.

Мишките, за разлика от хората, могат да синтезират ендогенно витамин С и изглеждат малко повлияни от екзогенен витамин С (Grollman and Lehninger, 1957; Chatterjee et al., 1975). Въпреки това, прилагането на големи количества витамин С увеличава циркулиращите концентрации на витамин С до високи нива. Лечението с големи количества витамин С намалява значително наддаването на тегло при мишки, хранени с HFD, което е паралелно на други доклади, показващи, че добавянето на витамин С води до загуба на тегло при хората (Naylor et al., 1985; da Silva et al., 2012; Johnston, 2005) и животни (Campion et al., 2006; Kim et al., 2018). Данните от проучването също така показват, че витамин С е обратно свързан с телесното тегло, затлъстяването и съотношението на измерване на талията и ханша (Kant, 2003; Canoy et al., 2005; Johnston et al., 2006; da Silva et al., 2012).

В съответствие с ефектите на витамин С върху масата на мезентериалната мастна тъкан, хистологичното изследване на участъци от мезентериална мастна тъкан разкрива, че добавянето на витамин С значително намалява средния размер на адипоцитите при индуцирани от HFD затлъстели мишки, което показва, че витамин С може да стимулира превръщането на големи адипоцити в по-малки адипоцити. Хипертрофичните адипоцити повишават циркулиращите нива на мастни киселини и възпалителни цитокини, което води до непоносимост към глюкоза, инсулинова резистентност, неалкохолна мастна чернодробна болест и сърдечно-съдови заболявания (Després and Lemieux, 2006; Jeong and Yoon, 2009; Kim et al., 2017). Въз основа на тези резултати, показващи, че витамин С инхибира хипертрофия на висцералните адипоцити, витамин С може да служи като обещаващ терапевтичен подход за лечение на висцерално затлъстяване и свързани метаболитни заболявания.

Излишното натрупване на липиди в мастните тъкани се насърчава от редица транскрипционни фактори, включително PPARγ, SREBP-1c, и членове на семейството на CCAAT/енхансер-свързващи протеини (Ntambi et al., 2000; Rosen and MacDougald, 2006; Tang and Lane, 2012). Тези главни регулатори на адипогенезата и липогенезата функционират чрез индуциране на транскрипция на мишени като SCD1, FAS и ацетил-КоА карбоксилаза (Rosen and MacDougald, 2006; Strable and Ntambi, 2010). Въоръжени с това знание за това как се натрупва излишък от липиди в мастната тъкан, ние след това изследвахме дали намаляването на висцералната маса на мастната тъкан и размера на адипоцитите, предизвикано от лечението с витамин С, може да бъде причинено от инхибиторни ефекти на витамин С върху мастната експресия на липогенезата - свързани гени. Наблюдавахме, че добавянето на витамин С намалява нивата на иРНК на SCD1 и SREBP-1c в мастните тъкани на HFD мишки. Тези резултати предполагат, че витамин С може да намали висцералното затлъстяване и хипертрофията на адипоцитите отчасти чрез намаляване на мастната експресия на гени, участващи в липогенезата.

Освен това показахме, че хроничният прием на HFD повишава нивата на кръвната захар на гладно, но че лечението с витамин С значително намалява концентрацията на глюкоза при HFD затлъстели мишки. Успоредно със своите способности за понижаване на глюкозата, витамин С намалява нивата на кръвната захар по време на орални тестове за толерантност към глюкоза, което предполага, че витамин С може да облекчи нарушен глюкозен толеранс на затлъстели мишки. В съответствие с нашите резултати, е доказано, че добавките с витамин С намаляват нивата на кръвната глюкоза при ob/ob мишки и плъхове, хранени с диета, както и при пациенти с T2D (Abdel-Wahab et al., 2002; Garcia-Diaz et al., 2014; Ashor et al., 2017). Освен това, Williams et al. (2016) съобщават, че хранителните добавки с витамини Е и С отслабват индуцираната от дексаметазон глюкозна непоносимост при плъхове. Взети заедно, тези резултати показват, че добавките с витамин С потискат хипергликемията и непоносимостта към глюкоза през 15 седмици прием на HFD.

Добре известно е, че инсулиновата резистентност при затлъстяване е свързана с разширяване на β-клетъчната маса на островчета, както е показано в генетични и индуцирани от диета модели на затлъстяване (Winzell и Ahrén, 2004; Ahrén et al., 2010). Като се има предвид, че ендокринните клетки на панкреатичните островчета играят важна роля в метаболизма на глюкозата, ние изследвахме H & E оцветени секции на панкреаса в LFD, HFD и HFD-VC миши групи. Изследването разкри, че размерът на панкреатичните островчета е значително по-висок при HFD мишки, отколкото при LFD мишки и намалява при HFD-VC мишки до размер, подобен на този при LFD мишки.

В заключение показахме, че витамин С инхибира хипертрофията на висцералните адипоцити и непоносимостта към глюкоза чрез регулиране на висцералната мастна експресия на гени, участващи в липогенезата при затлъстели мишки, хранени с HFD. Тези открития предполагат, че витамин С може да бъде обещаващ терапевтичен подход за предотвратяване и лечение на висцерално затлъстяване и непоносимост към глюкоза.

Тази работа е подкрепена от Националната изследователска фондация на Корея (NRF), финансирана от правителството на Корея (MEST) (2015R1A1A3A04001016).

Авторите съобщават, че няма конфликт на интереси.