Катедра по вътрешни болести, Отдел по гастроентерология, Университет в Модена и Реджо Емилия, Модена, Италия

Група за жени в хепатологията, Модена, Италия

Група за жени в хепатологията, Модена, Италия

Национален институт по гастроентерология, „С. de Bellis ”болница за изследване, Кастелана Гроте, Италия

Катедра по вътрешни болести, Отдел по гастроентерология, Университет в Модена и Реджо Емилия, Модена, Италия

Група за жени в хепатологията, Модена, Италия

Отделение по вътрешни болести, Ендокринологично звено, AOU от Парма, Парма, Италия

Катедра по вътрешни болести, Отдел по гастроентерология, Университет в Модена и Реджо Емилия, Модена, Италия

Катедра по вътрешни болести, Отдел по гастроентерология, Университет в Модена и Реджо Емилия, Модена, Италия

Група за жени в хепатологията, Модена, Италия

Кореспонденция

Ерика Вила, Катедра по вътрешни болести, Отдел по гастроентерология, Университет в Модена и Реджо Емилия, Модена, Италия.

Катедра по вътрешни болести, Отдел по гастроентерология, Университет в Модена и Реджо Емилия, Модена, Италия

Група за жени в хепатологията, Модена, Италия

Група за жени в хепатологията, Модена, Италия

Национален институт по гастроентерология, „С. de Bellis ”болница за изследване, Кастелана Гроте, Италия

Катедра по вътрешни болести, Отдел по гастроентерология, Университет в Модена и Реджо Емилия, Модена, Италия

Група за жени в хепатологията, Модена, Италия

Отделение по вътрешни болести, Ендокринологично звено, AOU от Парма, Парма, Италия

Катедра по вътрешни болести, Отдел по гастроентерология, Университет в Модена и Реджо Емилия, Модена, Италия

Катедра по вътрешни болести, Отдел по гастроентерология, Университет в Модена и Реджо Емилия, Модена, Италия

Група за жени в хепатологията, Модена, Италия

Кореспонденция

Ерика Вила, Катедра по вътрешни болести, Отдел по гастроентерология, Университет в Модена и Реджо Емилия, Модена, Италия.

Резюме

1. ВЪВЕДЕНИЕ

Няколко метаболитни проучвания разкриват, че регионалното разпределение на мазнините в тялото е по-подходящо от общото количество телесни мазнини при прогнозирането на развитието на свързаните със затлъстяването съпътстващи заболявания. 13, 14 По-специално количеството на висцералната мастна тъкан (ДДС) и ектопичното отлагане на мазнини са критично свързани с повишен риск от развитие на сърдечно-съдови и метаболитни нарушения. 14 Тези нарушения, свързани със затлъстяването, са известни като метаболитен синдром и присъстват в повечето случаи на затлъстяване. 15 Плазмените свободни мастни киселини (FFA), освободени от повишен AT при пациенти със затлъстяване, формират важна връзка между затлъстяването и метаболитния синдром. 16 Увеличеният поток на FFA към черния дроб и мускулите насърчава липотоксичността, променя действието на инсулина и води до неалкохолно мастно чернодробно заболяване (NAFLD), спектър от чернодробни тъканни промени, вариращи от стеатоза до неалкохолен стеатохепатит (NASH), цироза и хепатоцелуларни карцином. 4

рибка

2 ИНВИВО ПОДХОД ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ НА ЗАТЪЛВАНЕТО В ЛАРВИ ZEBRAFISH

2.1 Липидно оцветяване

За да се разберат по-добре промените във физиологията на даден организъм, причинени от затлъстяването, моделът зебра може да се използва за проследяване на произхода на адипогенезата, от оплождането на яйцеклетките до състоянието на ларвите. При бозайниците има два основни класа AT: кафява мастна тъкан (BAT), която разсейва енергията и генерира топлина, и бяла мастна тъкан (WAT), предназначена за съхранение на енергия и регулиране на енергийния баланс. За съжаление, механизмите, участващи в тяхното развитие и регулиране, все още не са ясни 20, отчасти поради трудности, свързани с изобразяването на AT в моделни системи на бозайници, особено през ранните етапи от живота.

Ларвите на зебрата, които се развиват извън тялото на майката и са оптически прозрачни, са подходящи инструменти за микроскопично и биохимично изследване на липидния транспорт и за скрининг на дефекти в усвояването, транспортирането и разположението на липидите. В действителност, липидният метаболизъм, затлъстяването, сърдечно-съдовите увреждания и метаболитните заболявания са широко проучени в този модел. 17, 21 Zebrafish притежават всички специализирани клетъчни типове, участващи в усвояването и преработката на липидите (напр. Чревни ентероцити, складиращи мазнини адипоцити, хепатоцити в черния дроб и ацинарни клетки на панкреаса). 22, 23 Адипоцитите могат да бъдат визуализирани при развиване на ларви на риба зебра с различни багрила, като например суданофилната боя Oil Red O (ORO), Судан, Нил Червено или Липидно зелено. 24 За да се оцени мобилизирането и транспортирането на мастни киселини, се използва липофилният флуорофор BODIPY ®: когато се инжектира в жълтъка на зебра, той бързо се дифузира в рамките на 3 часа в кръвоносната система. 25

Ларвите на зебрата започват да се хранят на 5-6 дни след оплождането (dpf); през този период те абсорбират основни мастноразтворими витамини, триацилглицерол (TAG) и холестерол, осигурени от майчина жълтъчна торбичка. 26 На етапа на 5 dpf ларви липидите присъстват в много тъкани, включително незначително натрупване в хепатоцитите. Първите признаци на адипогенеза стават видими при 8 dpf във висцералната кухина близо до панкреаса. Адипоцитите се появяват и в 12 dpf ларви в панкреаса. 26

Използвайки оцветяване по Нил Червено, адипоцитите са ясно видими при 15 dpf във висцералната област (интраабдоминални и околните вътрешни органи), 20 локализация, свързана при хора с по-неблагоприятни рискови фактори за развитие на T2DM. 27, 28 Броят на адипоцитите е свързан с размера на ларвите, а не с възрастта, което предполага, че съхранението на липидите, зависещо от дължината на тялото, в адипоцитите. Докато при 17 dpf, всички ларви имат WAT в панкреатичната и висцералната област, при 20-22 dpf се развиват, в зависимост от размера, подкожни (SL> 8.2 mm) и черепни (SL> 9.4 mm) адипоцити. 29

Липидното оцветяване позволява проследяване на диетичната абсорбция на липиди, следвайки протокол за течно хранене с високо съдържание на мазнини при ларви на данио: след инкубация в продължение на 1 час в 4% разтвор на мазнина (съдържащ тежка сметана за разбиване), предното черво и междусегментните съдове на ларвите 6 dpf показа силно оцветяване с ORO. Увеличението на нивото на оцветяване с ORO корелира с TAG на цели ларви.

2.2 In situ хибридизация и иРНК маркери за затлъстяване

Неотдавнашно проучване съобщи за първи път, че транскрипционният фактор SOX6 действа като активатор на адипогенезата преди PPARG и специфичен за мезодерма транскрипт (MEST) чрез директно свързване с техните промотори. Основните функции на SOX6 в адипогенезата се запазват между хората и другите гръбначни животни, както е показано in vivo в хомозиготни нуклеотидни ларви на риба зебра в sox6. Тези открития са важна стъпка в изследването на хипотетичната пряка роля на феталния произход на човешкото затлъстяване и неговото постнатално развитие. 41

2.3 Генна манипулация за проследяване на генната експресия in vivo

Едно от основните предимства на даниото е простотата и ефективността на манипулацията на генната експресия. Мутантните и трансгенни риби, при които генната експресия е била дерегулирана, позволяват in vivo изследвания на молекулярно ниво на пътя, участващ в болестите. Нещо повече, трансгенните ларви на зебра могат да експресират флуоресцентни протеини в специфични клетъчни типове, които след това лесно се откриват в прозрачните ларви, което позволява проследяване на развитието и развитието на затлъстяването. Освен това, ембрионите и ларвите на зебра до 5 dpf не са обект на същите регулаторни изисквания като възрастните бозайници, което увеличава стойността на този високопроизводителен инструмент.

Използване на трансгени (Таблица 1), напр. Риба зебра Tg (hPPARγ‐EGFP) 42, включващ зелен флуоресцентен протеин (GFP) под регулаторен контрол на гена, който представлява интерес, е възможно да се наблюдават живите тъкани и да се изследват специфични лекарствени действия. Интересно проучване, проведено в този модел, е тествало обезогенния потенциал на химикалите, на които сме изложени ежедневно в нашата среда, оценявайки натрупването на липиди и неговата корелация с капацитета им да активират PPARG при ларвите на данио. 43

Tg(-2.8fabp10a: gfp-gank)

Tg(-2.8fabp10a: HBV.HBx-GFP)

Tg (-2.8fabp10a: EGFP-yy1b)

Чернодробният свързващ протеин с мастни киселини (L-FABP) позволява специфична за черния дроб експресия на зелен флуоресцентен протеин (GFP)

Gankyrin (ганк)

Хепатит В вирус X протеин

Вездесъщ транскрипционен фактор Ин Ян 1 (YY1)

Модификацията на тяхната експресия е в състояние да индуцира чернодробна стеатоза при зебра

Наскоро няколко проучвания съобщават за ключова роля на макрофагите при възпалението на мастната тъкан. Идентифицират се различни участващи молекули, но основният механизъм все още остава неясен. Репортерската линия на макрофагите от риба зебра Tg (lyz: Ds Red) е използван за изследване на инфилтрация на макрофаги в мастната тъкан при зебра. 44 Лизозим С (LysC) Съобщава се, че експресията специално маркира макрофагното отделение върху жълтъка на ларвите. Изследвания, базирани на флуоресцентни репортери, биха помогнали на учените да изяснят, използвайки in vivo мониторинг, механизми за възпалително активиране и процеси, които предизвикват трансформация от здрава в патологична мастна тъкан.

Затлъстяването е единственият най-важен рисков фактор за развитие на стеатоза и ларвите на данио развиват стеатоза. Честотата и степента на стеатоза са по-тежки при рибите, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, съдържаща холестерол (HFC). Чернодробното натрупване на липиди в ларвите повишава надеждността на HFC модела за скрининг на потенциални антистеатозни лекарства. 45

Друго предимство на ларвите на данио е създаването на преходно събаряне на генната експресия чрез използване на морфолино (MOs) 46, което позволява бързо и ефективно изследване на генната функция. Това обаче е ограничено до ранните етапи на развитие. Например ларвите, инжектирани с MO-ApoC2 (Аполипопротеин С2), проявяват неасорбиран фенотип на жълтъка. В резултат на обратната генетика при зебрата, апоС2, необходим за сглобяването на липопротеини при хора, е установено, че е от съществено значение по време на развитието на ларвите на зебра. 47 Мобилизацията на мазнини в отговор на глад и повторно хранене също е проучена при ларвите на данио. Забелязано е, че когато рибите са гладували в продължение на 4 дни, неутралните липидни депа се намаляват на всички места, докато всички мазнини се разтворят на 7 дни глад. Дохранването в продължение на 4 дни беше достатъчно за възстановяване на неутрални липидни депа на същите места, както преди глад. 24 Тези наблюдения са в съответствие с данните при хората.

Докладчикът за трансгенната биолуминесценция на зебрата Tg (pck1: Luc2) се използва за идентифициране на метаболитно активни лекарства в процеса на глюконеогенеза в отговор на прехода „хранене на гладно“. Цитозолната фосфоенолпируват-карбоксикиназа (PCK1) промоторът се индуцира, когато въглехидратите в храната са ниски. Неговият протеин катализира регулаторен етап в глюконеогенезата в черния дроб и бъбреците. PCK1 транскрипцията е под инсулинов контрол по време на хранене и под контрол на глюкагон, глюкокортикоиди и адреналин по време на гладно. 48 Тези модели могат да се използват за по-нататъшно разследване и ще бъдат от особено значение в тази епоха на хранителни разстройства и нездравословни диети.

3 МОДЕЛ ЗА ИНДУКЦИЯ ЗА ЗАТЪРСЕНИЕ ПРИ ВЪЗРАСТНИ ZEBRAFISH

Допълнителна постоянна характеристика и при двата модела беше изключително високата степен на развитие на затлъстяването и затлъстяването на черния дроб. Това е в контраст с моделите на гризачи, при които само част от третираните животни развиват тези условия. 53, 54 Интересното е, че зебрафите са били хранени по схема за хранене, която е много подобна на хранителните навици на хората. Подобен подход е предложен и при гризачи, но използването на диети, които се различават по състав на хранителните вещества, енергийна плътност, консистенция и вкус, са довели до противоречиви данни със значителни разлики между опитни животни. Само когато храната се предоставяше непрекъснато, денонощно, затлъстяването постоянно се развиваше. 55

Анализът на микрочиповете на чернодробната тъкан от моделите на зебрафис при индуцирано от диетата затлъстяване разкрива модел на генна експресия, който прилича на човешки NAFLD. 56 Сравненията между анализа на ДНК микрочипове на зебрафи и ДДС на бозайници разкриха, че гените, участващи в коагулацията на кръвта, активирането на тромбоцитите и метаболизма на липидите, са значително дерегулирани при затлъстели зебрафи и бозайници (мишки, плъхове и хора). Нещо повече, индуцираното от диетата затлъстяване при зебра отговаря на ограничаване на калориите и на лечение с естествени съединения (зелен чай, домат Campari, ресвератрол) чрез намаляване на ИТМ и модифициране на експресията на гени, свързани със затлъстяването. 57-59

Напоследък е създаден модел на T2DM при риба зебра. 68 За да се разработи диетичен модел на затлъстяване с хипергликемия, рибите са били хранени с увеличено количество търговска храна. По отношение на калориите, всяко прехранено животно е снабдено с 408 калории/ден спрямо 150 калории/ден, използвани от Oka et al. 49 Този режим е в състояние много бързо да индуцира увеличаване на ИТМ, обема на мастната тъкан и плазмените триглицериди, както и нарушен глюкозен толеранс, повишено производство на инсулин и повишена β-клетъчна маса, в съответствие с модела на инсулинова резистентност на T2DM. Забележително е, че този модел на T2DM реагира на антидиабетни лекарства (метформин и глимепирид) и има транскриптомни пътища, подобни на човешките заболявания. 69

Всички цитирани модели на диета, предизвикано от затлъстяване при риба зебра, създават възможност използването на това животно за изследване на развитието на затлъстяване и свързано със затлъстяването заболяване в система, която прилича на патологията на човек/бозайник. За съжаление все още не е формулирана стандартизирана диета за общо приложение при зебра. 70 Както е съобщено в Таблица 2, досега са използвани няколко режима на хранене, които се различават по калории, съдържание на мазнини и състав. Диетите, които се различават по своя хранителен състав, пораждат разлики в енергийния прием, състава на тялото и отлагането на AT. В допълнение към усложненията, произтичащи от променливата диета, условията на отглеждане също могат да повлияят на разхода на енергия и, като следствие, на калорийния баланс. 55, 70