Съобщава се за промени в чревния микробен състав и серумния метаболом при пациенти на хемодиализа.

микробиота

Изследвания върху животни предполагат, че много уремични токсини са с чревен микробен произход.

Какви са новите открития?

Фекалните и серумните метаболоми на пациентите с краен стадий на бъбречно заболяване (ESRD) са в тясна корелация и се характеризират с натрупване на няколко уремични токсини и вторични жлъчни киселини (SBA).

Изглежда, че чревната микробиота е важна детерминанта на фекалния и серумен метаболитен пейзаж на гостоприемника, особено обогатяването на уремични токсини и SBA при пациенти с ESRD е свързано с разграждането на ароматните аминокиселини, медиирано от чревни микробиоми и биосинтезата на SBA на микроби.

Идентифицирахме група от свързани с ESRD микробни видове, които изглежда са причината за производството на уремични токсини и SBA.

Трансплантация на ESRD микробиота от пациенти с ESRD индуцира по-висока продукция на серумни уремични токсини и влошена бъбречна фиброза и оксидативен стрес при мишки без увредени бъбреци и лекувани с антибиотици плъхове.

Обогатените с ESRD Eggerthella lenta и Fusobacterium nucleatum увеличават производството на уремични токсини и насърчават развитието на бъбречно заболяване в модела на хронична бъбречна болест на плъхове, а пробиотикът Bifidobacterium animalis намалява нивата на токсини и тежестта на заболяването при плъхове.

Значение на това проучване

Как може да се отрази на клиничната практика в обозримо бъдеще?

Аберантен чревен микробиом при пациенти с ESRD може да допринесе за тежестта на заболяването.

Трябва да се проучат терапевтичните подходи, включващи модулация на чревната микробиота като допълнителна терапия за диализа.

Въведение

Краен стадий на бъбречно заболяване (ESRD), напреднало усложнение на хронично бъбречно заболяване (CKD), 1 е сред водещите причини за заболеваемост и смъртност в световен мащаб.2 3 Понастоящем разходите за лечение на ESRD са потресаващи; само в САЩ се изчислява на приблизително 34 милиарда щатски долара годишно.4 Прогресията на ХБН до ESRD и нейните усложнения са тясно свързани с натрупването на токсични метаболити в кръвта и други метаболитни отдели.5–7 Значителна част от тези токсини са получена от чревната микробиота8 9 и често не може да бъде елиминирана ефективно чрез диализа.5 Значителни промени в структурата на чревния микробиом при пациенти с CKD10-14 и нарушаване на метаболитния състав на кръвта и фекалиите при пациенти на хемодиализа с ESRD15-17 предполагат съществуването на микробиоми метаболитна дисрегулация при ХБН. Въпреки това, микробният произход на свързаните с ESRD метаболити, като уремични токсини и механизмите, които са в основата на промените, причинени от чревната микробиота в метаболомите на ESRD, не са напълно проучени. Такива изследвания могат да дадат терапевтични прозрения, както е разкрито от скорошно проучване, в което модулацията на специфични чревни микроби е показала, че регулира концентрациите на циркулиращ уремичен токсин, индоксил сулфат.

Тук извършихме цялостно проучване, интегриращо многоизмерни набори от данни за чревния микробиом, серумни и фекални метаболоми и характеристики на гостоприемника, основани на клинични данни и извлечени от въпросника (наричани „феномен“), от мащабна кохорта от 223 хемодиализи пациенти и 69 здрави контроли, съобразени с възрастовия стадий, телесното тегло и хранителния режим и независима кохорта за валидиране от 24 индивида (допълнителна онлайн таблица 1). Работният процес на изследването е описан в допълнителната онлайн фигура 1, а производството на данни се отчита в допълнителната онлайн таблица 2.

Допълнителен материал

Допълнителен материал

Резултати

Серумните метаболоми на пациенти с ESRD и здрави индивиди са различни

Серумните проби бяха анализирани чрез нецелена масова спектрометрия (MS) и профилите на изобилие бяха получени за 180 анотирани серумни метаболити. ESRD и контролните серумни метаболоми са ясно различни (фигура 1А); 134 от 180 метаболити са имали значително различни количества (допълнителна онлайн таблица 3). Като се има предвид хетерогенността на популацията пациенти спрямо типовете първично заболяване (протопатия), ние я разделихме на трите основни типа, гломерулонефрит (n = 76), диабетна нефропатия (n = 73) и други (n = 74) и сравнихме отделно всеки с контролната популация. Във всеки случай разликите в метаболомите са сравними, улавяйки ≥97% от серумните метаболити, разкрити като различни в цялата популация, и само малък брой метаболити (2 = 1.7%). Кохерентно, състоянието на ESRD е основната причина за разликата между метаболомите на пациента и контролния серум (фигура 1В), тъй като обяснява почти 11% от вариацията, докато други биоклинични променливи (напр. Пол, телесно тегло и обща концентрация на холестерол в кръвта) ) колективно обяснени допълнителни 8,5%; трите основни типа протопатия не повлияват значително серумния метаболом.

Различни серумни и фекални микробиомни характеристики, свързани с пациенти с ESRD. (А) Разделяне на серумния метаболом между пациенти с ESRD и здрави контроли, разкрито чрез анализ на основните компоненти (PCA). Метаболитите, определени като основни фактори за разделянето, са обозначени с диаманти. (B) Ефективен размер на фенотипните индекси, които допринасят значително за дисперсията (R 2) на серумния метаболом (adonis p 2) на фекалния метаболом (adonis p 2 = 0,43%), въпреки че значително влияе върху серумния метаболом. По-специално, състоянието на ESRD отново е основната причина за разликата между метаболомите на пациента и контролните фекалии, дори ако това обяснява по-ниска част от вариацията (4.2%, фигура 1Е), отколкото в серума (10.9%). Други биоклинични променливи колективно обясняват допълнителни 5,8% от дисперсията; диабетният статус е допринесъл значително.

Анализът на прокрусти демонстрира силна кооперативност на серумния и фекалния метаболомен профил (фигура 1F). Най-важното е, че серумните уремични токсини и техните фекални предшественици са в тясна корелация (допълнителна онлайн фигура 6), което предполага, че метаболитните промени в чревния тракт на пациенти с ESRD допринасят значително за натрупването на уремични токсини в серума.

Промяната на чревния микробен състав при пациенти с ESRD допринася за производството на уремичен токсин и биосинтезата на вторичната жлъчна киселина. Мрежов изглед на уремични токсини/SBA и MGS. квадратите представляват уремичните токсини или SBA, а околните свързани кръгове представляват видовете, използвани в случайните горски модели. ESRD, краен стадий на бъбречно заболяване; MGSs, метагеномни видове; SBA, вторични жлъчни киселини; TMAO, триметиламин N-оксид.

Важно е, че видовете, свързани с производството на уремичен токсин или SBA, корелират пряко и силно с най-важните клинични променливи на ESRD (допълнителна онлайн фигура 16). По-специално, високият дял на дисперсията (средно 50,8%) на eGFR и нивата на циркулиращи креатинин, урея, С реактивен протеин и хемоглобин се определят от изобилието на видовете (допълнителна онлайн таблица 17). Следователно ние предполагаме, че чревният микробиом влошава ESRD поне отчасти чрез уремични токсини и SBA.

Модел, базиран на видовете, обсъдени по-горе, осигурява площ под кривата на работна характеристика на приемника от 0,97 за стратификация/контролна стратификация (допълнителна онлайн фигура 17А), значително по-висока от стойностите, отчетени от моделите на микробиота на червата, разработени за класифициране на метаболитни и сърдечно-съдови заболявания. 31 36 37 В този модел Eubacterium spp, Flavonifractor spp и E. lenta са допринесли основно (допълнителна онлайн фигура 17B). Тези открития предполагат, че микробите, участващи в производството на уремичен токсин и SBA, могат да се използват като диагностични маркери за ESRD.

Модулацията на чревния микробиом в модели на гризачи с ХБН влияе върху натрупването на токсини и тежестта на бъбречните заболявания

Предложен механизъм на влошаване на ESRD от променения чревен микробиом. схематично резюме, илюстриращо потока от метаболити от чревната микробиота към фекалиите и след това към серума, засягащи клиничния статус на пациента. Обогатените с ESRD и изчерпани микробни видове, функции и фекални/серумни метаболити са обозначени съответно в червено и синьо. Обогатяването на видове като Eggerthella lenta, Fusobacterium nucleatum и Alistipes shahii води до повишено разграждане на AAA, биосинтез на SBA и TMAO в червата, което води до по-високи нива на уремични токсини и SBA във фекалиите и кръвта на пациенти с ESRD. Едновременно с това изчерпването на видове като Faecalibacterium prausnitzii, Roseburia и Prevotella води до намален биосинтез на SCFA в червата. Такъв неблагоприятен метаболизъм, задвижван от чревната микробиота, може да влоши прогресията на ХБН, да предизвика усложнения и системно възпаление и да увеличи смъртността на пациентите с ESRD. AAA, ароматна аминокиселина; ESRD, краен стадий на бъбречно заболяване; SBA, вторична жлъчна киселина; SCFA, късоверижна мастна киселина; TMAO, триметиламин N-оксид.

Тази работа помага да се установи причинно-следствена връзка между анормална чревна микробиота и прогресия на бъбречните заболявания при хора. Някои от чревните микробиотични производни на уремичните токсини, включително индоксил сулфат, р-крезол сулфат, фенилацетилглутамин и TMAO са били повишени както при CKD19 48 49, така и при пациенти с ESRD и са свързани с прогресията на CKD, смъртността, основните неблагоприятни сърдечно-съдови събития и други тежки клинични крайни точки. 14 50 Токсини като IS и PCS са експериментално доказани, че индуцират бъбречна фиброза и причиняват значителни бъбречни тубулни увреждания при плъхове с ХБН.50 В съгласие, измерването на E. lenta или F. nucleatum повишава съответните им токсини в серума и влошена бъбречна фиброза при 5/6 модел на нефректомия плъх. Тези открития подкрепят значението на обогатените с ESRD видове, произвеждащи токсини, за развитието на болестта и подсилват модела, че увеличаването на получените от червата уремични токсини може да влоши прогресията на бъбречното заболяване.

Чревната бариера често е нарушена при пациенти с ESRD, 51 насърчавайки проникването на предшественици на уремичен токсин в кръвоносната система. Това би допринесло за натрупването на серумни токсини. Доказано е, че преобладаващото системно възпаление при пациенти с уремия може отчасти да се дължи на нарушение на тяхната чревна бариерна функция.52 Нашите скорошни открития демонстрират, че микробиотата от пациенти с ESRD може да наруши чревната бариера, като произвежда прекомерен фенол. очаквано увреждане или нарушаване на чревната бариера, повече уремични токсини могат да проникнат в циркулацията на пациенти с ESRD, влошавайки развитието на бъбречно заболяване и неговите усложнения.

Хората с бъбречна недостатъчност, които редовно се лекуват с диализа, както тези, изследвани в настоящото проучване, страдат от индуциран от токсини остатъчен уремичен синдром, 54 състояние, което сериозно компрометира качеството им на живот. Една от причините за натрупването на токсини при пациенти с ESRD е, че някои уремични токсини, получени от чревната микробиота, не могат да бъдат ефективно отстранени чрез традиционната диализа. Следователно има голяма необходимост в бъдещи клинично контролирани проучвания на пациенти с различна степен на увредена бъбречна функция да се изследва дали модулацията на чревната микробиота чрез диета, пробиотици или други терапевтични средства може да облекчи опустошителните симптоми на остатъчния синдром, да подобри оцеляването и качество на живота или отложете необходимостта от диализно лечение или бъбречна трансплантация, изискващо ресурси.

Методи

Проучване дизайн и събиране на проби

Общо 223 пациенти на хемодиализа бяха наети от четири центъра за хемодиализа в Пекин, Китай. Всички участници са били диагностицирани с ESRD според бъбречната болест: Подобряване на насоките за клинична практика на глобалните резултати и са били подложени на стабилна хемодиализа (1–3 пъти седмично). Контролната група включва 69 здрави доброволци. Кохортата за валидиране се състоеше от 12 пациенти с ESRD и 12 здрави контроли, съобразени с пола и възрастта. Критериите за изключване на контролите включват хипертония, диабет, затлъстяване, метаболитен синдром, възпалително заболяване на червата, рак, нарушена чернодробна или бъбречна функция, дислипидемия. Лицата са изключени, ако са приемали антибиотици в рамките на 30 дни или пробиотични продукти в рамките на 14 дни.

Кръвни проби от пациенти са били взети непосредствено преди хемодиализа в болница, докато здрави контролни проби са били взети по време на физически преглед. Серумът се изолира и съхранява при -80 ° C. Проби от пресни фекалии са получени по същото време като вземането на кръв; всяка проба се разделя на две части, една част се съхранява в разтвор за защита на ДНК при 4 ° C, ДНК екстракции се извършват в пробата в рамките на 2 месеца. Другият беше замразен при -80 ° C, който се използва за метаболомичен анализ в рамките на 2 месеца. Проведени са клинично-химични анализи на кръвни проби, измервания на основно антропометрично и фекално рН и анкетно проучване (допълнителна онлайн таблица 1).

Профилиране на метаболоми на серумни и фекални проби

Профилирането на метаболитно серумно изследване се анализира с помощта на течен хроматограф с ултрависока производителност (HPLC) (Waters, САЩ), съчетан с масов спектрометър tropleTOF 5600 плюс (Applied Biosystems, USA). Общо бяха измерени 6600 пика на метаболита и 180 от тях бяха структурно идентифицирани и анотирани според вътрешна база данни LC-MS/MS. Сред тях пет метаболита бяха допълнително количествено определени в шестдесет произволно избрани серумни проби чрез външни калибрационни криви, използващи Shimadzu nexera x2 ultra HPLC (Shimadzu, Япония), съчетани с троен квадруполен масспектрометър (Shimadzu 8050, Япония).

Екстракция на ДНК на фекалиите и метагеномно секвениране

Общата фекална ДНК беше извлечена с помощта на стандартни методи.37 Пробите от пресни геномни ДНК бяха механично фрагментирани до

400 bp с Bioruptor Pico (Diagenode, Белгия). Метод, основан на магнитни мъниста, беше използван за подбор на фрагменти на ДНК след стандартен протокол (Agencourt AMPure XP). Библиотеките бяха подготвени с помощта на NEBnext Ultra II DNA Library Prep Kit за Illumina (New England BioLabs). Тогава платформата Illumina HiSeq X Ten беше използвана за секвениране на цели метагеноми с двойни краища 2 × 150 bp. Отстранени бяха нискокачествени или човешки геномни ДНК отчитания.

Биоинформатични и статистически анализи

Всички методи бяха подробно описани в допълнителни онлайн материали, а статистическите скриптове бяха достъпни на https://github.com/lish2/omics.

Експерименти с животни

Всички проучвания върху животни са одобрени от Етичния комитет по експериментални грижи за животните на Китайския земеделски университет. За експерименти с FMT върху животни, 13 пациенти с ESRD и 13 здрави контроли от първоначалните 292 субекта са избрани като донори. Експериментите с FMT са проведени при мишки без микроби и лекувани с антибиотици плъхове. За експерименти с единичен щам са проведени две независими проучвания върху животни, за да се тества ролята на E. lenta или F. nucleatum (проучване 1) и пробиотици (проучване 2, Bifidobacterium animalis A6) при бъбречно заболяване.

Подробности за проучвания върху животни, включително събиране на проби, приготвяне на бактериална култура и бактериална суспензия, екстракция и секвениране на ДНК, количествена PCR в реално време, количествено определяне на серумни уремични токсини, както и хистологични и имунохистохимични анализи, са достъпни в онлайн допълнителни материали.