Наталия Г. Колосова

1 Институт по цитология и генетика SB RAS, Новосибирск, Русия

n-ацетилцистеин

2 Институт по митоинженеринг, Москва, Русия

Наталия А. Стефанова

1 Институт по цитология и генетика SB RAS, Новосибирск, Русия

Наталия А. Муралева

1 Институт по цитология и генетика SB RAS, Новосибирск, Русия

Владимир П. Скулачев

2 Институт по митоинженеринг, Москва, Русия

3 Московски държавен университет "Ломоносов", Институт по физико-химична биология "Белозерски", Москва, Русия

Резюме

Въпреки че антиоксидантите са многократно тествани в животински модели и клинични проучвания, няма доказателства, че антиоксидантите намаляват вече развития възрастов спад. Наскоро демонстрирахме, че насоченият към митохондрии антиоксидант 10- (6'-пластохинонил) децилтрифенилфосфоний (SkQ1) забавя някои прояви на стареене. Тук сравнихме ефектите на SkQ1 и N-ацетил-L-цистеин (NAC) върху зависимия от възрастта спад на кръвните нива на левкоцити, растежен хормон (GH), инсулиноподобен растежен фактор-1 (IGF-1), тестостерон, дехидроепиандростерон (DHEA) при плъхове Wistar и ускорено стареене OXYS. Когато започна късно в живота, добавките с SkQ1 не само предотвратиха свързания с възрастта спад, но и значително го обърнаха. При NAC всички наблюдавани ефекти са с по-ниска величина в сравнение със SkQ1 (въпреки тази доза NAC е 16000 пъти по-висока). Предполагаме, че добавянето с ниски дози SkQ1 е обещаваща намеса за постигане на здравословно стареене.

ВЪВЕДЕНИЕ

Стареенето обикновено се определя като прогресивни вредни промени, които водят до повишен риск от заболяване и смърт с напредване на възрастта [1-3]. Вече са на разположение няколко потенциални терапевтични подхода за забавяне на свързания с възрастта функционален спад на организма [4-17], включително лечение с антиоксиданти [1, 18, 19]. Всъщност генерирането на реактивни кислородни видове (ROS) от митохондриите се счита за един от механизмите на стареене [20-28]. Съвременните антиоксиданти обаче не са селективни към митохондриите и това може да попречи на тяхната ефективност [29]. В продължение на седем години изследвахме забавяне на стареенето с митохондрийно насочен антиоксидант SkQ1 [10- (6'-пластохинонил) децилтрифенилфосфоний]. SkQ1 е антиоксидант, селективно насочен към митохондриите, който предпазва митохондриите от окислително увреждане и за който е доказано, че намалява митохондриалните увреждания при животински модели на оксидативен стрес [29, 30]. Ние показахме, че SkQ1 увеличава средната продължителност на живота на организмите, а също така забавя, арестува и в някои случаи дори обръща развитието на много свързани с възрастта патологични черти [29-34].

С остаряването настъпва сложна промяна на имунната система. Имуно-стареенето се определя като намалена клетъчна реактивност и дисбаланс между възпалителни и противовъзпалителни мрежи, което води до нискостепенно, хронично, противовъзпалително състояние, известно още като „възпаление“ [35-39]. Стареенето засяга всички имунни клетки и води до висока податливост към инфекции и повишена смъртност, наблюдавана при възрастните хора. Следователно свързаните с възрастта промени в имунните клетки могат да служат като маркер за здраве, биологична възраст и дълголетие [40].

Тук оценихме ефекта на насочения към митохондриите антиоксидант SkQ1 върху маркерите на стареенето при старите плъхове OXYS, уникален животински модел на ускорено стареене и свързани с възрастта заболявания, както и на нормални плъхове Wistar. Плъховете OXYS спонтанно развиват няколко патологични фенотипа, подобни на човешките гериатрични разстройства, включително катаракта, ретинопатия, остеопороза, високо кръвно налягане и поведенчески промени [41-50]. Повечето от тези прояви на ускорено стареене се развиват при плъхове OXYS между 1 и 3 месеца от живота. Наскоро показахме, че SkQ1 при наномоларни концентрации е способен не само да предотврати спада на имунната система и развитието на катаракта и ретинопатия, но също така може да обърне вече развити патологични промени в лещата и ретината на плъхове OXYS, както и някои свързани с възрастта промени в поведение [29, 51-53].

За сравнение използвахме N-ацетил-L-цистеин (NAC) като нецелеви антиоксидант. Доказано е, че NAC предотвратява свързаните с възрастта когнитивни дефекти и окислителния спад на митохондриалните функции в мозъка [54, 55].

РЕЗУЛТАТИ

Телесно тегло

Анализи на белите кръвни клетки

Нива на серумния GH

Нивото на GH естествено намалява с възрастта при плъхове от двата щама, макар и по-дълбоко при плъхове OXYS, отколкото при плъхове Wistar (p (Таблица 3). 3). В началото на добавянето с антиоксиданти експерименталните групи не се различават по нивата на GH (p = 0,49 за Wistar, p = 0,52 за OXYS).

Таблица 3

ЩамВъзраст, месецЛечениеGHIGF-1ТестостеронDHEA
Wistar308,14 ± 0,2535 ± 621,42 ± 0,3-
19.05,28 ± 0,1 + 483 ± 70,61 ± 0,04 + 0,66 ± 0,01
23.04,98 ± 0,2 + 448 ± 12 + 0,60 ± 0,070,63 ± 0,02 +
SkQ15,50 ± 0,1 # ^ 500 ± 9 # 0,61 ± 0,050,66 ± 0,01
NAC5,37 ± 0,2 ^ 486 ± 10 # 0,61 ± 0,030,66 ± 0,03
OXYS306,24 ± 0,3 * 498 ± 641,99 ± 0,31-
19.04,57 ± 0,1 * + 444 ± 7 * + 0,64 ± 0,06 + 0,58 ± 0,01 *
23.04,27 ± 0,1 * + 399 ± 9 * + 0,56 ± 0,020,55 ± 0,03 * +
SkQ14,80 ± 0,1 # ^ 499 ± 9 # ^ 0,58 ± 0,020,60 ± 0,02 ^
NAC4,58 ± 0,08 ^ 449 ± 13 # 0,57 ± 0,020,59 ± 0,02

След 4-месечно лечение с NAC или SkQ1 нивата на GH остават по-ниски при плъхове OXYS (F1.42 = 49.6, p (Таблица 3). 3). В началото на лечението с антиоксиданти експерименталните групи не се различават по нивата на IGF-1 (p = 0,87 за Wistar и p = 0,81 за OXYS плъхове).

ДИСКУСИЯ

Нашите резултати показват, че когато се започне късно в живота, лечението със SkQ1 не само предотвратява свързания с възрастта спад, но и частично го обръща. Ефектите на NAC са с по-ниска величина в сравнение със SkQ1, въпреки използваната по-висока доза NAC.

Една от причините за загуба на телесно тегло в напреднала възраст е саркопенията - постепенно намаляване на мускулната маса. След 4-месечно лечение с антиоксиданти телесното тегло на плъховете OXYS и Wistar намаля само леко. В третираната група SkQ1 теглото е много подобно на теглото на контролните плъхове и в двата щама на плъхове. Тези открития са в съответствие с непубликувани данни на L.E. Бакеева и В.Б. Сапрунова, която установи, че SkQ1 намалява свързания с възрастта спад на мускулната маса при плъхове OXYS и Wistar. Друга причина за намаляване на телесното тегло в напреднала възраст е остеопорозата, която води до повишен риск от фрактури. Храненето с SkQ1 предотвратява загубата на минерално съдържание, свързано със сенилна остеопороза при плъхове OXYS [34]. В нашето проучване сдвоеното зависимо сравнение показа, че телесното тегло е намаляло значително (p (Таблица 3). 3). Добре известно е, че GH/IGF-I играе важна роля за стареенето на мозъка [65, 66]. Свързаното с възрастта намаляване на дейностите на соматотропната ос може да повлияе на мозъчната функция при възрастните хора [67]. Наскоро показахме, че лечението с SkQ1 на плъхове Wistar и OXYS на средна възраст (12 месеца) имаше благоприятни ефекти върху опорно-двигателния и изследователския процес. SkQ1 също намалява тревожността в сравнение с контролите, съответстващи на възрастта, както и значително подобрява зрителните способности на плъховете OXYS, страдащи от ретинопатия и катаракта [49]. В настоящото проучване наблюдавахме положителен ефект на SkQ1 и NAC върху поведението на плъхове от двата щама (данните не са показани). В последната серия от експерименти изследвахме ефекта на SkQ1 върху нивата на растежен хормон и IGF-1 при 3-месечни плъхове (данните не са показани). Установихме, че SkQ1 причинява малко (около 25%), но статистически валидно повишаване на нивото на кръвен хормон. Освен това SkQ1 предотвратява развитието на ретинопатия и катаракта и има благоприятни ефекти върху поведението, способността за учене и паметта на плъховете OXYS. Предполагаме, че възстановяването на GH - IGF-I в напреднала възраст до нивата на тези в млада възраст може да има положително въздействие върху функцията на застаряващия мозък и имунната система.

На възраст между 3 и 19 месеца нивата на тестостерон спадат и след това остават непроменени между 19 и 23 месеца при плъхове от двата щама. Не беше изненадващо, че няма разлика между нивата на тестостерон дори при старите животни. Както беше показано по-рано в нашата група, мъжете от OXYS демонстрират ранно намаляване на сексуалната мотивация; обаче намаление на хормоналния компонент на сексуалното поведение не е установено при възрастни мъже OXYS [68]. Наскоро показахме, че SkQ1 е ефективен не само за предотвратяване, но и за намаляване на вече развития възрастов спад в мъжкото сексуално поведение [69]. В настоящото проучване не направихме оценка на сексуалното поведение и нито SkQ1, нито NAC лечението повлияха нивата на тестостерон в периода между 19 и 23 месеца (Таблица (Таблица 3). 3). Забележително е, че NAC инхибира частично пътя на mTOR (Target of Rapamycin) [70]. Като се има предвид участието на mTOR в клетъчното и организмовото стареене, както и свързаните с възрастта заболявания [71-78], лекото инхибиране на mTOR може да допринесе за терапевтичните ефекти на този неселективен антиоксидант.

DHEA и неговата сулфатно-свързана форма (DHEAS) са важни предшественици на половите стероидни хормони. Структурата на DHEA е подобна на тестостерона и нивата на двата хормона достигат максималните си нива в пубертета и драстично намаляват с възрастта [79]. Предвид множествените му метаболитни ефекти, се смята, че този спад в нивата на DHEA играе роля в процеса на стареене [80]. В това проучване можем да приемем, че нивата на DHEA са максимални при 3-месечни плъхове Wistar и OXYS. На възраст между 19 и 23 месеца нивата на DHEA намаляват и SkQ1 леко увеличават DHEA (с 5%).

Недостигът на множество хормони е биомаркер за здравословното състояние на възрастните хора [79].

Тук заключаваме, че SkQ1 не само предотвратява свързаните с възрастта хормонални промени, но частично ги обръща. Тези резултати предполагат, че добавянето с ниски дози SkQ1, дори при хронологично и биологично възрастни лица, изглежда обещаваща стратегия за поддържане на здравето и забавяне на процеса на стареене.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Животни и диета

Мъжки OXYS с ускорено стареене и съответстващи на възрастта мъжки плъхове Wistar са получени от лабораторията за експериментални животни за разплод към Института по цитология и генетика (ICG), Сибирско отделение на Руската академия на науките (Новосибирск, Русия). Всички експерименти върху плъхове са проведени съгласно Правилата за грижа за животните на Института по цитология и генетика на ICG, Новосибирск. Щамът на плъх OXYS е създаден въз основа на щам на плъх Wistar в Института по цитология и генетика, както е описано по-рано [51, 52] и регистриран в базата данни за генома на плъхове (http://rgd.mcw.edu/). На възраст от 4 седмици малките бяха отнети от майките си и настанени в групи от по пет животни на клетка (57 × 36 × 20 cm) и държани при стандартни лабораторни условия (при 22 ± 2 ° C, 60% относителна влажност и естествена светлина), снабден със стандартен фураж за гризачи, PK-120-1, Ltd. (Laboratorsnab, Русия), и даден вода ad libitum.

Започвайки от 19-месечна възраст плъховете OXYS и Wistar са разпределени на случаен принцип в три групи (n = 17–24): контролна диета, диета, допълнена с 250 nmol SkQ1 (синтезирана, както е описано по-рано [33]) или 650 mg NAC (MP Biomedicals, LLC, Франция) на кг телесно тегло на ден. Теглото е измерено преди началото на лечението и в края на експеримента.

Нивата на хормона и броя на белите кръвни клетки

Нивата на GH, IGF-1, тестостерон и DHEA-S в кръвния серум бяха анализирани преди и след лечение със SkQ1 или NAC при плъхове OXYS и Wistar (два пъти общо за всеки плъх) и сравнени с интактни 3-месечни плъхове (n = 10) от същите щамове. GH, DHEA се измерват с ELISA (Creative Diagnostics, САЩ). IGF-1 се измерва с ELISA (ALPCO Diagnostics, Salem, NH). Тестостеронът е измерен чрез ELISA (JSC Vector-Best, Русия). Анализите се провеждат, като се използват инструкциите на производителя. За броя на левкоцитите периферната кръв е взета от опашната вена. Кръвните мазки се фиксират в метанол и впоследствие се оцветяват с Wright-Giemsa.

Статистически анализ

Данните бяха анализирани с помощта на многократни измервания ANOVA и непараметрични тестове със статистическия пакет Statistica 6.0. Двупосочен ANOVA се използва за оценка на разликите между щамовете на плъхове (генотипове) и ефектите от лечението (антиоксиданти). За да се потвърди ефектът от диетите върху параметрите, генотипът и антиоксидантите бяха избрани като независими променливи. Поставен hoc тест на Newman-Keuls беше приложен към значителни основни ефекти и взаимодействия, за да се оценят разликите между определени набори от средства. Еднопосочната ANOVA е използвана за индивидуални групови сравнения. Данните са представени като средно ± S.E.M. Сравненията между средните стойности бяха анализирани с еднопосочен или повтарящ се дисперсионен анализ (ANOVA). Резултатите се считат за статистически значими, ако р стойността е по-малка от 0,05.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства от Руската фондация за фундаментални изследвания (проекти N 11-04-00666 и N 12-04-00091).

Бележки под линия

Авторите на този ръкопис нямат конфликт на интереси, който да декларират.