Автори: Сандра Талънт, Дженифър Хайт, Реджиналд У. Бенет (оттегляне) и Гейл А. Лансет (оттегляне)

aureus

История на ревизиите:

  • Март 2016: Температурата за инкубация на S. aureus е променена на 35-37 ° C, от 35 ° C.

Методите, използвани за откриване и изброяване на S. aureus, зависят от причините за тестване на храната и от миналата история на тестовия материал. Преработените храни могат да съдържат относително малък брой изтощени жизнеспособни клетки, чието присъствие трябва да се докаже с подходящи средства. Анализът на храната за S. aureus може да доведе до съдебни действия срещу страната или страните, отговорни за замърсена храна. Методите за анализ на S. aureus, които са проучени съвместно и са намерени за подходящи за използване при предоставяне на вида информация, необходима за изискванията на FDA, са представени в тази глава.

Съществуват значителни противоречия относно значимостта и правилния метод на разчитане на коагулазния тест. Резултатите от изследванията показват, че слабата коагулазна активност, представена от 1+, 2+ и 3+ реакции, рядко отговаря на други критерии, свързани със S. aureus (4). Консенсус на връстници установи, че 4+ коагулазна реакция е необходима за безспорна идентификация на S. aureus. Тези щамове, за които се подозира, че са S. aureus въз основа на коагулазни реакции под 4+, трябва да бъдат потвърдени от други тестове, като анаеробна ферментация на глюкоза, чувствителност към лизостафин и производство на термонуклеаза. Изследвания на колониална морфология на агар на Baird-Parker, чувствителност към лизостафин, производство на коагулаза и термонуклеаза и ферментация на глюкоза и манитол са проведени върху 100 ентеротоксигенни и 51 нетеротоксигенни щама на S. aureus (3). Във всички случаи реакциите на ентеротоксигенни и ненентеротоксигенни щамове варират с 12% или по-малко. Това изследване показва, че на нито един от тези тестове не може да се разчита, за да се разграничат токсичните и нетоксичните стафилококи.

Метод с директно броене на плочи

Този метод е подходящ за анализ на храни, в които може да се очакват над 100 S. aureus клетки/g. Съответства на метода в реф. 1.

Оборудване и материали

  1. Същото основно оборудване като при конвенционалния брой плочи (Глава 3).
  2. Сушилня или инкубатор за сушене на повърхността на агаровите плочи
  3. Стерилни огънати пръчки от стъклени ивици, хокей или стик, с полирани краища, диаметър 3-4 mm, дължина 15-20 cm, с ъглова разстилаща се повърхност с дължина 45-55 mm

  1. Baird-Parker среда (M17)
  2. Триптиказен (триптичен) соев агар (TSA) (M152)
  3. Мозъчна инфузия на сърцето (BHI) бульон (M24)
  4. Коагулазна плазма (заек) с EDTA
  5. Толуидиново синьо-ДНК агар (M148)
  6. Лизостафин (Schwartz-Mann, Mountain View Ave., Orangeburg, NY 10962)
  7. Екстракт от триптонов дрожден агар (M165)
  8. Парафиново масло, стерилно
  9. 0,02 М фосфатно-физиологичен разтвор (R61), съдържащ 1% NaCl
  10. Тест за каталаза (R12)
  • Подготовка на пробата (виж глава 1 на BAM).

    Изолиране и изброяване на S. aureus

    Прехвърлете заподозрените колонии на S. aureus в малки епруветки, съдържащи 0,2-0,3 ml BHI бульон и старателно емулгирайте. Инокулирайте агарен наклон на подходяща среда за поддържане, например TSA, с циклична суспензия BHI. Инкубирайте BHI културна суспензия и наклони 18-24 h при 35-37 ° C. Съхранявайте наклонени култури при стайна температура за допълнителни или повторни тестове, в случай че резултатите от теста за коагулаза са под въпрос. Добавете 0,5 ml разтворена коагулазна плазма с EDTA (B-4, по-горе) към BHI културата и разбъркайте добре. Инкубирайте при 35-37 ° C и изследвайте периодично в продължение на 6 часа за образуване на съсиреци. Само положителен и пълен съсирек, който остава на място, когато тръбата е наклонена или обърната, се счита за положителен за S. aureus. Частичното съсирване, по-рано 2+ и 3+ коагулазни реакции, трябва да се тества допълнително (4). Тествайте известни положителни и отрицателни култури едновременно със съмнителни култури с неизвестна коагулазна активност. Оцветете всички съмнителни култури с Грам реагент и наблюдавайте микроскопски. Тест за лагусна аглутинация (AUREUS TEST TM, Trisum Corp., Тайпе, Тайван) може да бъде заменен с коагулазния тест, ако се желае по-бърза процедура.

    Таблица 1. Типични характеристики на S. aureus, S. epidermidis и микрококи (a)

    Характеристика S. aureus S. epidermidis Micrococci Каталазна активност Производство на коагулаза Производство на термонуклеаза Лизостафинова чувствителност Анаеробно използване на глюкозата манитол
    + + +
    + - -
    + - -
    + + -
    + + -
    + - -
    a +, Повечето (90% или повече) щамове са положителни; -, повечето (90% или повече) щамове са отрицателни.

    Метод с най-вероятния брой за Staphylococcus spp.

    Методът с най-вероятния брой (MPN) (2) се препоръчва за рутинно наблюдение на продукти, при които се очаква малък брой S. aureus и в храни, които се очаква да съдържат голяма популация от конкуриращи се видове.

    1. Оборудване и материали - Същото като при метода за директно броене на плочи, по-горе.
    2. Среда и реагенти - Същото като при метода за директно броене на плочи, по-горе. В допълнение: триптиказен (триптичен) соев бульон (TSB), съдържащ 10% NaCl и 1% натриев пируват (M154a).
    3. Подготовка на пробата - Същата като при метода за директно преброяване на плочи, по-горе.

    Определяне на MPN

    Инокулирайте 3 туби TSB, съдържащи 10% NaCl и 1% натриев пируват (В, по-горе), с порции от 1 ml десетични разреждания от всяка проба. Най-високото разреждане трябва да дава отрицателна крайна точка. Инкубирайте епруветките 48 ± 2 часа при 35-37 ° C. Използвайки 3 mm контур, прехвърлете 1 контур от всяка тръба, показващ растеж (мътност), върху плоча от среда на Baird-Parker с правилно изсушена повърхност. Смесете вихрови тръби преди ивици, ако растежът се вижда само отдолу или отстрани на тръбите. Инокулум на ивици за получаване на изолирани колонии. Инкубирайте плаките 48 часа при 35-37 ° C. От всяка плака, показваща растеж, прехвърлете поне 1 колония, за която се подозира S. aureus, в BHI бульон (вж. D и E от метода за директно преброяване на плаки, по-горе). Продължете процедурата за идентифициране и потвърждаване на S. aureus (E и F, Direct Plate Count, по-горе). Отчетете S. aureus/g като MPN/g, съгласно таблиците в Приложение 2, Определяне на MPN.

    Препратки

    1. AOAC INTERNATIONAL. 1995. Официални методи за анализ, 16-то издание, сек. 975,55. AOAC INTERNATIONAL, Арлингтън, Вирджиния.
    2. AOAC INTERNATIONAL. 1995. Официални методи за анализ, 16-то издание, сек. 987.09. AOAC INTERNATIONAL, Арлингтън, Вирджиния.
    3. Bennett, R.W., M. Yeterian, W. Smith, C.M. Coles, M. Sassaman и F.D. McClure. 1986. Идентификационни характеристики на Staphylococcusaureus и ентеротоксигенност. J. Food Sci.51: 1337-1339.
    4. Sperber, W.H. и S.R. Татини. 1975. Тълкуване на теста за коагулаза на тръбата за идентифициране на Staphylococcusaureus. Приложение Микробиол.29: 502-505.

    Хипертекст Източник: Бактериологичен аналитичен наръчник, 8-мо издание, Ревизия A, 1998. Глава 12.