От Бъбречна служба и лаборатория, болница Universitario, Instituto de Investigaciones Biomédicas (Fundacite-Zulia), Universidad del Zulia (B.R.-I., Y.Q.), Маракайбо, Венецуела; и Отделението по нефрология и хипертония, Катедра по медицина, физиология и биофизика, Калифорнийски университет (C.-D.Z., R.K.S., N.D.V.), Ървайн.

От Бъбречна служба и лаборатория, болница Universitario, Instituto de Investigaciones Biomédicas (Fundacite-Zulia), Universidad del Zulia (B.R.-I., Y.Q.), Маракайбо, Венецуела; и Отделението по нефрология и хипертония, Катедра по медицина, физиология и биофизика, Калифорнийски университет (C.-D.Z., R.K.S., N.D.V.), Ървайн.

От Бъбречна служба и лаборатория, болница Universitario, Instituto de Investigaciones Biomédicas (Fundacite-Zulia), Universidad del Zulia (B.R.-I., Y.Q.), Маракайбо, Венецуела; и Отделението по нефрология и хипертония, Катедра по медицина, физиология и биофизика, Калифорнийски университет (C.-D.Z., R.K.S., N.D.V.), Ървайн.

От Бъбречна служба и лаборатория, болница Universitario, Instituto de Investigaciones Biomédicas (Fundacite-Zulia), Universidad del Zulia (B.R.-I., Y.Q.), Маракайбо, Венецуела; и Отделението по нефрология и хипертония, Катедра по медицина, физиология и биофизика, Калифорнийски университет (C.-D.Z., R.K.S., N.D.V.), Ървайн.

От Бъбречна служба и лаборатория, болница Universitario, Instituto de Investigaciones Biomédicas (Fundacite-Zulia), Universidad del Zulia (B.R.-I., Y.Q.), Маракайбо, Венецуела; и Отделението по нефрология и хипертония, Катедра по медицина, физиология и биофизика, Калифорнийски университет (C.-D.Z., R.K.S., N.D.V.), Ървайн.

Преглеждате най-новата версия на тази статия. Предишни версии:

Резюме

Хипертоничните ефекти на оксидативния стрес са последица, поне отчасти, на ендотелната дисфункция в резултат на нарушения на вазодилататорните системи, особено разграждане на азотния оксид от свободните кислородни радикали. 24–26 В допълнение, оксидативният стрес в бъбреците може да участва в патогенезата на задържането на сол. Ние предположихме, че бъбречната инфилтрация на имунокомпетентни клетки може да играе роля в патогенезата на чувствителната към сол хипертония. 27,28 Тубулоинтерстициалната инфилтрация на лимфоцити и макрофаги е свързана с генерирането на реактивни кислородни видове (ROS) и клетки, продуциращи ангиотензин II в експериментални модели на хипертония. 29–32 В резултат на това може да се развие повишена реабсорбция на натрий, нарушена натриуреза под налягане и намален филтриран натрий, причинени от гломерулна вазоконстрикция, 33 налагайки патофизиологично състояние, благоприятстващо задържането на натрий (прегледано от Johnson et al 34).

Предишни проучвания от нашата група показват, че намаляването на имунната инфилтрация с имуносупресивно лекарство, микофенолат мофетил, подобрява оксидативния стрес, както и хипертонията. 29–32 Настоящите разследвания изследват противоположната страна на същия въпрос: дали дългосрочното приложение на богата на антиоксиданти диета би намалило бъбречната имунна инфилтрация, както и би подобрило системната хипертония.

Нашите открития показват, че богата на антиоксиданти диета подобрява хипертонията при спонтанно хипертонични плъхове (SHR) във връзка с намаляване на инфилтрацията на лимфоцити и макрофаги в тубулоинтерстициалните области на бъбреците.

Методи

Животни и експериментален дизайн

Проведени са експерименти с SHR и контролни плъхове Wistar-Kyoto (WKY), получени от Charles River Laboratories. Едноседмично бременни плъхове и техните потомци са били хранени или с обикновена лабораторна диета за гризачи, или с тестова диета, приготвена чрез добавяне към редовната диета на витамин Е, витамин С, цинк и селен. Диетите са закупени от Purina Mills Inc. Разликите в състава на обикновената диета и тестовата диета са показани в таблицата. Мъжкото потомство се наблюдава в продължение на 7 месеца

Витамин Е, витамин С, цинк и селен Съдържание на редовните и тестовите диети *

Животните бяха настанени в контролирано от температурата пространство, регулирано от светлина с 12-часови светлинни и тъмни цикли и им беше предоставен неограничен достъп до храна и вода по време на експериментите. Протоколът, използван в това проучване, е одобрен от комитета за грижи и употреба на животните от Калифорнийския университет, Ървайн.

Бременните животни и техните потомци са разпределени на случаен принцип в следните експериментални групи (n = 5 всяка): група SHR-R, състояща се от плъхове SHR, на които се дава редовна диета през целия експеримент (7 месеца); Група SHR-T, състояща се от SHR плъхове, на които е дадена тестова (богата на антиоксиданти) диета по време на експеримента; Група SHR-S, състояща се от плъхове, които са получавали тестова диета в продължение на 4 месеца и след това са преминали към редовна диета за останалите 3 месеца; и групата WKY, състояща се от плъхове WKY, които получават редовна диета по време на експериментите.

В края на експериментите животните се евтаназират след анестезия с интраперитонеални инжекции на пентобарбитал натрий (Nembutal, 50 mg/kg). Взема се кръв и се отстраняват бъбреците. Единият бъбрек е използван за хистологични и имунохистологични изследвания, а другият бъбрек е използван за определяне на съдържанието на малондиалдехид (MDA).

Креатининът в серума и урината се определя чрез комплект, закупен от Sigma Chemical Inc. Концентрациите на протеини в урината и креатинин са определени в 24-часовите колекции на урина.

Плазмен водороден прекис

Концентрацията на H2O2 в плазмата се определя чрез количествения комплект за анализ на H2O2 (OXIS International Inc). Изобилието на нитротирозин в бъбречната тъкан се определя чрез Western blot анализ, както е описано в по-ранните ни проучвания. 9

Определяне на кръвното налягане

Кръвното налягане се определя чрез плетизмография на маншета, както е описано по-горе. 35 Съзнателни плъхове бяха поставени върху нагрята подложка в контролирана от температурата тиха стая. След 15 минути почивка с опашката, поставена в маншета на опашката, маншетът се надува 3 до 4 пъти, за да подготви животното за процедурата; Бяха направени и записани 4 последователни измервания (Harvard Appair Inc).

Хистология

За хистологични изследвания бяха използвани коронални 3- до 4-μm участъци от вградена в парафин тъкан, фиксирани в 10% буфериран формалин (American Master * Tech Scientific, Inc). Периодичната киселина-Шиф (PAS), трихромната и оцветяването с хематоксилин и еозин бяха използвани за оценка на светлинните микроскопски находки. Изследвани са целият корен и юкстамедуларен регион. Гломерулосклерозата се дефинира като PAS-оцветен материал без клетъчни елементи със или без адхезия към капсулата на Bowman. Гломерулосклерозата се класифицира по резултата, описан от Raij 36 и подробно описан в предишни съобщения. 30 Тубулоинтерстициалните увреждания са класифицирани според степента (%) на областите на тубулни увреждания по скала, варираща от 0 до 5+, описана по-рано 30–32: 0 = липсват промени; 1 + = 2. 29–32

Антисеруми

Лимфоцитите бяха идентифицирани с анти-CD5 моноклонално антитяло (клон MRCOX19, Biosource) и макрофаги с анти-ED1 моноклонално антитяло (Harlan Bioproducts). Клетките, продуциращи ангиотензин II, са изследвани със заешки анти-човешки антисеруми за ангиотензин II (полуостровни лаборатории) с кръстосана реактивност спрямо ангиотензин II на плъхове. 29–32 Вторични антитела срещу мишки и магарета срещу заек с минимална кръстосана реактивност към серумни протеини на плъхове са получени от Accurate Chemical and Scientific Co.

Бъбречен MDA

Съдържанието на MDA в бъбреците се определя в бъбречни хомогенати по метода на Buege и Aust. 37

Статистически изчисления

Сравненията между групите бяха направени чрез използване на многогрупов ANOVA анализ. Значителни разлики бяха оценени с посттестове на Tukey-Kramer. Асоциациите между променливите бяха изследвани с линейни (Pearson), както и непараметрични (Spearman) коефициенти на корелация. Разликите се считат за значими, когато двустранните тестове показват стойности на P

диета

Фигура 1. Систолично кръвно налягане в края на експерименталния период. Всички експериментални групи са имали значително (P

Клетъчна инфилтрация

Кломерите не показват значителна инфилтрация на лимфоцити и макрофаги. Интрагломеруларните лимфоцити (CD5-положителни клетки/gcs) са 0,2 ± 0,27 при плъхове WKY и 0,25 ± 0,29, 0,3 ± 0,45 и 0,1 ± 0,22 при SHR-R, SHR-S и SHR-T, съответно. Макрофагите (ED1-положителни клетки/gcs) също са сходни във всички групи (WKY = 0,4 ± 0,42, SHR-R = 0,38 ± 0,48, SHR-S = 0,30 ± 0,27, SHR-T = 0,20 ± 0,27).

За разлика от това, в експерименталните групи имаше значителни разлики в тубулоинтерстициалната инфилтрация на лимфоцити и макрофаги. SHR плъховете от всички групи са имали значително по-голям брой CD5-позитивни клетки, отколкото WKY плъхове. Както е показано на Фигура 2, по-интензивното проникване на CD5-положителни клетки се наблюдава при плъхове, отглеждани на редовна диета (SHR-R) и най-малък брой CD5-положителни клетки при плъхове, отглеждани на богата на антиоксиданти диета (SHR- Т). Плъхове, които са преминали от тестовата диета към обикновена диета (SHR-S), са имали междинни стойности (Фигура 2).

Фигура 2. Тубулоинтерстициална инфилтрация на лимфоцити (CD5-положителни клетки) при 7-месечни SHR плъхове, държани от раждането на редовна диета (SHR-R, затворена лента), плъхове преминаха от антиоксидантна диета след 4 месеца (SHR-S, сенчеста лента ) и плъхове, държани на богата на антиоксиданти тестова диета през цялото време (SHR-T, райета). *P

Инфилтрацията на макрофаги показва същия модел, като групата SHR-R показва най-голям брой ED1-положителни клетки. Плъховете, преминали от редовна към антиоксидантна диета (SHR-S), са имали междинна инфилтрация на макрофаги, а плъховете, държани на тестовата диета (SHR-T), са имали най-малък брой тубулоинтерстициални макрофаги (Фигура 3).

Фигура 3. Тубулоинтерстициална инфилтрация на макрофаги (ED1-положителни клетки) при 7-месечни SHR плъхове, държани от раждането на редовна диета (SHR-R, затворена лента), плъхове преминаха от антиоксидантна диета след 4 месеца (SHR-S, сенчеста лента ) и плъхове, държани на богата на антиоксиданти тестова диета през цялото време (SHR-T, райета). *P

Подобни находки бяха демонстрирани по отношение на ангиотензин II-положителни клетки. Както е показано на Фигура 4, антиоксидантната диета намалява броя на клетките, произвеждащи ангиотензин II. Този ефект е по-изразен при плъхове, които са били на тестова диета (Фигура 4).

Фигура 4. Ангиотензин II – положителни тубулоинтерстициални клетки в тубулоинтерстициум. SHR-R, SHR, поддържани на редовна диета; SHR-S, SHR премина от антиоксидантна диета към обикновена диета; SHR-T, SHR се държат на богата на антиоксиданти диета през цялото време. *P

Хистология

Светлинната микроскопия е по същество незабележима при всички групи плъхове. Гломерулите бяха нормални, с фокусни области с повишена клетъчност. Тубулоинтерстициалните области показват фокални области на дилатация, но трихромното и PAS оцветяване не показват области на фиброза. Резултатите от тубулоинтерстициално нараняване са сходни във всички експериментални групи SHR-R = 1,8 ± 0,45; SHR-S = 1,6 ± 0,55; SHR-T = 1,8 ± 0,55; WKY = 1,6 ± 0,55). Представителни фотомикрографии, показващи светлинна микроскопия и имунна хистология, са показани на фигура 5.

Фигура 5. A, Гломерули с частичен колапс на гломерулната туфа и фокална хиперцелуларност, заобиколена от тубули, някои от които са разширени и с частична загуба на епителни клетки, но запазена базална мембрана. Лимфоцитите (CD5-положителни клетки) и макрофагите (ED1-положителни клетки), инфилтриращи тубулоинтерстициални области, са показани в авидин-биотин пероксидазно оцветяване и FITC оцветяване, съответно, в В и С. Ангиотензин II-положителни тубуларни клетки и интерстициални клетки (пероксидазно оцветяване) са показани в D.

Имаше значителна корелация между нивата на систоличното кръвно налягане и инфилтрацията на лимфоцитите (r= 0,80, P

Фигура 6. Силно значими корелации между броя на лимфоцитите (A, r= 0,80, P

Дискусия

Дългосрочната консумация на диета, обогатена с антиоксиданти, започваща в пренаталния период, подобрява хипертонията и подобрява оксидативния стрес, както се вижда от намаляването на съдържанието на нитротирозин и MDA в тъканите, както и концентрацията на водороден пероксид в плазмата в групата SHR-T. Тези констатации са в съответствие с резултатите от краткосрочните проучвания, проведени от нашата група, използващи мощното антиоксидантно лазароидно съединение 22, както и тези, проведени от Schnackenberg et al 14, използващи супероксиддисмутазен миметичен агент tempol в този модел. Заедно тези проучвания предоставят убедителни доказателства за ролята на оксидативния стрес в патогенезата на хипертонията при SHR. По същия начин присъствието на оксидативен стрес и неговата роля за повишаване на артериалното налягане е показано при различни други форми на генетична и придобита хипертония, включително тази, наблюдавана при излагане на олово, 9 хронична бъбречна недостатъчност, 10 експериментален синдром X, 38 чувствителност към сол, 39 коарктация на аортата, 5 инфузия на ангиотензин, 40 прееклампсия, 41 и стеноза на бъбречна артерия. 42

В настоящото проучване използвахме антиоксидантен коктейл, който включваше витамин Е, витамин С, селен и цинк. По-ранни проучвания са документирали полезните ефекти на витамин Е и витамин С за подобряване на хипертонията при хипертоници 9,10,22 и подобряване на ендотелната функция при хора с хипертония. 43 Освен това е доказано, че селенът (критичният компонент на антиоксидантния ензим глутатион пероксидаза) забавя прогресирането на бъбречното заболяване при диабетни и недиабетни животни. 43 И накрая, цинкът е важен компонент на цитоплазмата (Cu-Zn SOD) и извънклетъчната супероксиддисмутаза, която служи като първа линия на защита срещу реактивни кислородни видове. Освен това е доказано, че недостигът на цинк влошава хипертонията при SHR. 44 Предвид естествения произход на тези хранителни вещества, тяхната ниска токсичност и наличност, ние избрахме да използваме тази комбинация вместо по-мощни, но по-малко достъпни и потенциално токсични съединения, като лазароид или темпол, използвани в предишни проучвания. 14,22

Перспективи

Основните констатации на това изследване са, първо, че SHR, консумиращи редовна диета, имат бъбречна инфилтрация на лимфоцити, макрофаги и ангиотензин II-положителни клетки във връзка с тежка хипертония, и второ, че антиоксидантно обогатената диета намалява бъбречната имунна инфилтрация и подобрява хипертонията.

Наблюдаваните ефекти са в съгласие с предишните ни проучвания в SHR, показващи, че намаляването на инфилтрацията на имунни клетки в бъбреците чрез прилагане на имуносупресивно противовъзпалително лекарство води до подобряване на хипертонията, което е съчетано с намаляване на бъбречното съдържание на малондиалдехид и брой супероксид-положителни клетки в бъбреците. 31 Както беше подчертано в неотдавнашен преглед, 4 оксидативният стрес може да бъде причина 8, както и последица 45 от хипертония и ако присъства в бъбреците, може да подхрани порочен кръг, който включва бъбречно възпаление и задържане на натрий. 34 Въпреки че наличните данни не позволяват окончателно заключение относно първичния или вторичния характер на възпалителния процес в патогенезата на хипертонията, данните предоставят убедителни доказателства за ролята му в поддържането на хипертонията.

Корелацията между интензивността на клетъчната инфилтрация и тежестта на хипертонията в настоящото изследване поражда възможността за причинно-следствена връзка, която трябва да бъде проучена допълнително. Освен това настоящите проучвания потвърждават, че диетичното антиоксидантно лечение подобрява хипертонията при SHR и предполагат, че този терапевтичен подход може да бъде от клинична употреба.

Това проучване беше финансирано отчасти от щедра субсидия, предоставена от Томас Юен (лаборатория на д-р Вазири) и грант FONACYT № S1–2001001097, Венецуела (лаборатория на д-р Родригес-Итурбе).