Junfeng Ma

1 Катедра по патология, Център за здравни науки на Университета в Оклахома, Оклахома Сити, Оклахома 73104

2 Лаборатория за предаване на сигнали на Едмънд Х. Фишер, Колеж по науки за живота, Университет Дзилин, Чанчун, 130012, Китай

Же Ли

1 Катедра по патология, Център за здравни науки на Университета в Оклахома, Оклахома Сити, Оклахома 73104

Шу Син

1 Катедра по патология, Център за здравни науки на Университета в Оклахома, Оклахома Сити, Оклахома 73104

2 Лаборатория за предаване на сигнали на Едмънд Х. Фишер, Колеж по науки за живота, Университет Дзилин, Чанчун, 130012, Китай

Искам Тина Хо

1 Катедра по патология, Център за здравни науки на Университета в Оклахома, Оклахома Сити, Оклахома 73104

Ксуеки Фу

2 Лаборатория за предаване на сигнали на Едмънд Х. Фишер, Колеж по науки за живота, Университет Дзилин, Чанчун, 130012, Китай

Жижуанг Джо Жао

1 Катедра по патология, Център за здравни науки на Университета в Оклахома, Оклахома Сити, Оклахома 73104

2 Лаборатория за предаване на сигнали на Едмънд Х. Фишер, Колеж по науки за живота, Университет Дзилин, Чанчун, 130012, Китай

Резюме

Чаят се консумира широко по целия свят. Проучванията показват ролята на чая за профилактика и лечение на различни хронични заболявания, включително диабет и затлъстяване, но основният механизъм е неясен. PTP1B е широко изразена тирозин фосфатаза, която е определена като цел за разработване на терапевтични лекарства за лечение на диабет и затлъстяване. При скрининг за инхибитори на PTP1B открихме, че водните екстракти от чайове показват мощни инхибиращи PTP1B ефекти със стойност IC50 от 0,4 до 4 g сухи чаени листа на литър вода. Черният чай показва най-силно инхибиране, последван от улун и след това от зелен чай. Биохимичните фракциониране демонстрират, че основните ефективни компоненти в чая съответстват на окислените полифенолни съединения. Това беше потвърдено допълнително от факта, че чайните катехини се превърнаха в мощни инхибитори на PTP1B при окисляване, катализирано от тирозинази. Когато се прилага върху култивирани клетки, екстрактите от чай индуцират фосфорилиране на тирозин на клетъчните протеини. Нашето проучване предполага, че някои полезни ефекти на чая могат да се отдадат на инхибирането на PTP1B.

Въведение

В светлината на PTP1B като цел за лекарства против диабет и затлъстяване, ние проверихме различни билкови продукти за техните способности да инхибират PTP1B. Нашето проучване разкри, че чаят, особено черният, съдържа мощни PTP1B инхибиторни дейности.

Материали и методи

Материали

ΔPTP1B и ΔTC-PTP, които представляват рекомбинантни протеини, съдържащи съответно каталитичните домени на PTP1B и TC-PTP, бяха пречистени от рекомбинантни клетки на E. coli, както беше описано по-рано за каталитичния домен на други PTPs [37, 38]. PTP субстрат пара-нитрофенилфосфат (p-NPP), (-) - епигалокатехин галат (EGCG), (-) - галокатехин галат (GCG), гъбена тирозиназа, говежди серумен албумин, буфери и соли са получени от Sigma-Aldrich. Обратно-фазовата колона C18 е закупена от Waters Corporation. Всички чайове са закупени от местните пазари.

Приготвяне на екстракти от чай

С изключение на използването на дейонична вода, екстрактите от чая (инфузии) се приготвят по начина, по който се прави нормален чай за пиене. Накратко, 0,2 g сухи чаени листа се добавят към 5 ml вряща вода в стъклена епруветка и се държат при 95 ° C върху нагревателен блок в продължение на 20 минути. След охлаждане до стайна температура супернатантата се събира и всички остатъци се отстраняват чрез центрофугиране. Концентрацията на суровите екстракти се определя като 40 g/L. Имайте предвид, че истинската концентрация на разтворените вещества в екстракта е значително по-малка, тъй като значителна част от чаените листа е неразтворима. Тази концентрация на екстракти от чай е еквивалентна на тази на обикновените пиещи чайове.

Анализи на PTP активност

Системата за анализ на активността на PTP съдържа 25 mM MOPS-NaOH (pH 7,0), 1 mM EDTA, 1 mM дитиотреитол, 1 mg/ml говежди серумен албумин, 0,1 M NaCl, 10 mM p-NPP и 40 nM рекомбинантен ΔPTP1B или ΔTC- PTP. Анализите се провеждат в общ обем от 100 μl с не повече от 10 μl екстракти от чай при стайна температура за 10 минути. Реакциите се прекратяват чрез добавяне на 800 μl 0,1 М натриев бикарбонат и се измерва абсорбцията при 410 nm за определяне на продукта, пара-нитрофенол. Празната проба се провежда без ензими. Една единица активност на PTP се определя като 1 nmol фосфат, отделен на минута. Стойността на IC50 се отнася до концентрацията на инхибитори, при която PTPs се инхибират с 50%. Една единица за инхибиране на PTP се дефинира като количеството инхибитори, необходимо да предизвика 50% намаляване на активността на PTP1B в нашата система за анализи.

Фракциониране на екстракти от чай

Използвана е колона с обратно фаза С18 за фракциониране на екстракти от чай за обогатяване на активността на инхибиране на PTP. Екстрактите от чай се зареждат в колоната, уравновесена с вода и след това се елуират с градиент от 0-100% метанол. Всяка фракция се проследява за абсорбция при 450 nm и се анализира за PTP1B инхибираща активност, както е описано по-горе.

Катализирана от тирозиназа окисляване на екстракти от чай и чаени катехини

Използвахме тирозиназа за окисляване на екстракти от чай и изолирани чайни катехини. Това по същество имитира процеса, който се случва по време на ферментацията на чая. Накратко, екстрактите от чай, EGCG и GCG бяха третирани с гъбена тирозиназа в гореспоменатия PTP буфер за анализ при стайна температура за различни периоди от време. Продуктите бяха директно използвани за тестове за инхибиране на РТР, както е описано по-горе.

Клетъчна култура и стимулация с екстракти от чай

NIH-3T3 клетки се култивират до почти сливане в DMEM среда, допълнена с 10% фатален говежди серум. След това клетките бяха третирани с различни екстракти от чай. След 30 минути инкубация, клетките се екстрахират в буфер за екстракция на цели клетки, съдържащ 25 mM β-глицерофосфат (рН 7,3), 5 mM EDTA, 2 mM EGTA, 5 mM β-меркаптоетанол, 1% Triton X-100, 0,1 M NaCl, и смес от инхибитори на протеаза (Roche Applied Science). След центрофугиране при 14 000 х g в продължение на 10 минути, супернатантите се разтварят в 10% SDS полиакриламиден гел и се прехвърлят в мембрана от поливинилиден флуорид (PVDF) за Western blot анализ с анти-фосфотирозинови антитела. Откриването беше направено с помощта на метода на усъвършенствана хемилуминесценция (ECL).

Резултати

Екстрактите от чай съдържат мощна инхибираща активност на PTP1B

Пречистихме ΔPTP1B, а именно каталитичния домен на PTP1B, от рекомбинантни клетки на Е. coli. Пречистеният ензим е по същество хомогенен и има специфична активност от 17 000 единици/mg при нашите условия на анализ при рН 7,0. Нашият буфер за анализ на PTP съдържа 50 mM MOPS-NaOH плюс 0.1M NaCl, за да имитира физиологичната йонна сила. С рекомбинантния ΔPTP1B проверихме много различни чайове за инхибиторни ефекти. Тези чайове се приготвят с вода, подобна на начина, по който се приготвят пиещите чайове. Те бяха слабо кисели (рН 6-7). Когато се добавят към системата за анализ, те не предизвикват промени в рН. Фигура 1А показва резултатите от тестовете за активност на PTP, получени с 12 чая. Всички те проявяват инхибираща активност на PTP1B, като черното показва най-силната активност, последвано от чай улун и след това зелени чайове. Сравнение на стойностите на IC50 за различните видове чайове е илюстрирано на фиг. 1Б. Средните стойности на IC50 за 4 черни чая са около 0,4 g/L, което съответства на разреждане на оригиналните екстракти от чай със 100 пъти. Улунът и зеленият чай показват средни стойности на IC50 съответно 2 и 4 g/L.

мощни

A. Активността на ΔPTP1B беше анализирана в присъствието на посочените концентрации на 11 различни чая (3 червени, 2 улуна и 6 зелени). Б.. Стойностите на IC50 бяха определени чрез анализ на активността на ΔPTP1B при различни концентрации на чайове. Данните представляват средни стойности на IC50 за всеки вид чай. ° С. Активността на ΔPTP1B и ΔTC-PTP се анализира в присъствието на посочени концентрации на черен и зелен чай. Анализите на PTP активност са започнати чрез добавяне на ензими. Лентите за грешки означават стандартно отклонение (n ≥ 3, освен ако не е посочено друго).

За да видим дали инхибиторната активност на чайовете има някаква селективност спрямо PTP1B, анализирахме паралелно активността на TC-PTP. Сред всички класически PTP, PTP1B споделя най-високата хомология с TC-PTP, показващ 54% идентичност и 70% сходство в аминокиселинните последователности. Следвайки подобна стратегия, използвана за ΔPTP1B, ние изолирахме ΔTC-PTP, каталитичния домейн на TC-PTP, от рекомбинантни клетки на Е. coli. Пречистеният ΔTC-PTP показва специфична каталитична активност, сравнима с тази на ΔPTP1B. Интересното е, че ΔTC-PTP изглежда е устойчив на инхибирането както от черни, така и от зелени екстракти със стойности на IC50 поне 20 пъти по-високи от тези, наблюдавани при ΔPTP1B (фиг. 1С). Тези данни демонстрират, че екстрактите от чай селективно инхибират PTP1B.

Предварителната инкубация на екстракти от чай с PTP увеличава инхибиторните ефекти

Кинетичният механизъм на инхибиране на PTP1B от екстракти от чай изглежда е сложен. От една страна, той проявява определени характеристики на конкурентоспособност, тъй като промяната на концентрацията на субстрата променя степента на инхибиране, но това не следва типичния модел на конкурентно инхибиране (данните не са показани). От друга страна, предварителната инкубация на ензима с екстрактите от чай значително подобрява инхибиторните ефекти (фиг. 2), което предполага участието на бавно свързване с ензима или химични модификации. Също така забелязахме, че намаляването на концентрацията на редуциращия реактив дитиотреитол повишава чувствителността към екстрактите от чай, което предполага участието на възможни реакции на окисление.

ΔPTP1B бяха предварително инкубирани с екстракт от черен чай при 1 g/L или екстракт от зелен чай при 3 g/L за посочени периоди от време. Анализите на PTP активност са започнати чрез добавяне на субстрат pNPP. Данните представляват относителна оставаща активност на PTP, а лентите за грешки означават стандартно отклонение (n = 3).

Инхибиращата активност на PTP1B на екстрактите от чай мигрира едновременно с интензивността на оцветителите на чая при хроматография с обратна фаза

За да се разделят ефективните компоненти в екстрактите от чай, ние ги фракционирахме върху хроматографски колони с обратна фаза C18. След елуиране на заредените колони с метанол успяхме да обогатим инхибиторната активност. Когато най-ефективните фракции бяха изсушени, претеглени и повторно разтворени във вода, успяхме да видим IC50 стойност от 50 mg разтворено вещество на литър вода в сравнение с 4 g сух чай/L в оригиналния зелен чай. Интересното е, че активността на инхибиране на PTP мигрира съвместно с жълто/червения цвят на фракциите на чая, както е показано чрез абсорбция при 450 nm (фиг. 3А). За простота, фиг. 3А илюстрира само данни, получени с екстракти от зелен чай. Подобни резултати бяха наблюдавани при черните и улун чайове. Заедно данните по същество обясняват защо екстрактите от черен чай показват по-дълбок цвят и по този начин притежават по-висока инхибираща активност на PTP1B от екстрактите от зелен чай.

A. Екстрактите от зелен чай се зареждат в колона С18, уравновесена с вода. След измиване с вода, колоната се елуира с градиент от 0-100% метанол. PTP1B инхибиторната активност на избрани фракции беше измерена и изразена като единици/ml. Измерва се и абсорбцията на всяка фракция при 450 nm, която съвпада с червения/жълтия цвят. Б. Екстракти от черен чай при 0,5 mg/ml, екстракти от зелен чай при 1 mg/ml, 50 μM EGCG и 50 μM GCG бяха инкубирани с 5 единици тирозиназа в PTP буфера за анализ (25 mM MOPS-NaOH, pH 7,0, 1 mM дитиотреитол, 1 mg/ml говежди серумен албумин, 0,1 М натриев хлорид) за 0, 1 и 10 часа. PTP анализите бяха започнати чрез добавяне на pNPP и ΔPTP1B. Лентите за грешки означават стандартно отклонение (n = 3).

Катализираната от тирозиназа окисляване на екстракти от чай и катехини генерира инхибираща активност на PTP1B

Екстрактите от чай индуцират фосфорилиране на тирозин на клетъчните протеини в култивираните клетки

Чрез инхибиране на активността на PTP, екстрактите от чай вероятно увеличават фосфорилирането на протеин тирозин. За да разберем дали това наистина е така, третирахме клетки NIH3T3 с екстракти от чай за 30 минути. Western blot анализът на клетъчни екстракти разкрива, че и трите вида чайове могат да индуцират силно фосфорилиране на тирозин на клетъчните протеини (фиг. 4). Идентичността на тези протеини трябва да бъде определена. Известно е, че PTP1B представлява основен PTP в клетки NIH-3T3 [39]. Възможно е инхибирането на PTP1B да е поне частично отговорно за повишеното фосфорилиране на тирозин. Концентрациите на екстракти от чай, използвани в тези експерименти, са еквивалентни на 20-кратно разредени чайове за пиене.

NIH-3T3 клетки се отглеждат до почти сливане в 2 ml пълна хранителна среда и след това се добавят 0,1 ml екстракти от чай (5 g/L) или вода. Клетките се култивират допълнително в продължение на 30 минути и след това се екстрахират в буфер за екстракция на цели клетки. Равни количества от общите протеини бяха подложени на Western blot анализ с анти-фосфотирзин (4G10) и анти-актинови антитела. Стрелките показват белтъци, чието фосфорилиране е значително индуцирано от екстракти от чай.

Дискусия

Нашето проучване показа, че екстрактите от чай инхибират PTP1B със стойности на IC от 0,4 до 4 g сухи чаени листа на литър вода. Тези концентрации съответстват на 10–100 пъти разреждания на обикновени пиещи чайове, които имат концентрация 4–40 g/L. Ако приемем, че всички активни компоненти могат да попаднат в циркулацията, количеството чайове, необходимо за постигане на ефективна концентрация на инхибиране на PTP1B в човешкото тяло, може лесно да бъде постигнато. В чая са идентифицирани хиляди различни флавоноиди [22]. Някои от тях са желателни и полезни за здравето, а други може да не са. За да се произвеждат терапевтични лекарства на основата на чай или хранителни добавки за профилактика или лечение на диабет и затлъстяване, някои от компонентите като кофеин трябва да бъдат премахнати, докато други компоненти като PTP1B-инхибиращите катехини трябва да бъдат обогатени, модифицирани и формулирани за подобряване ефикасност. С PTP1B като цел, нашето проучване предоставя и двата биохимични анализа за изолиране на ефективни компоненти за по-нататъшно разработване на терапевтично лекарство.

Преобладаващите доказателства подкрепят полезната роля на чайовете за профилактика и лечение на диабет и затлъстяване. Това може да бъде частично медиирано от инхибирането на PTP1B, добре установена цел за лечение на диабет и затлъстяване. Интересното е, че според няколко проучвания черните чайове изглеждат по-ефективни от зелените чайове [35, 36]. Това се съгласува с нашето наблюдение, че черните чайове притежават по-висока активност на инхибиране на PTP1B.

Прогнозира се процентът на възрастното население на САЩ, засегнато от диабет, да се увеличи от 14% през 2010 г. до 21% до 2050 г. [40]. Очаква се процентът на затлъстяването да достигне 42% до 2050 г. в САЩ [41]. С такива огромни проблеми на общественото здраве трябва да се борим от множество фронтове чрез управление на приема на наркотици, подбор на питателна храна и напитки и чрез поддържане на здравословен начин на живот. Чаят, дарбата на природата на човечеството, е представен във всички тези фронтове. Нашето проучване на инхибиторните ефекти на чая върху PTP1B предоставя нов арсенал за битката срещу диабета и затлъстяването.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства HL076309 и> HL079441 от Националните здравни институти, САЩ (към ZJ Zhao) и грант № 20090920 от План за развитие на науката и технологиите в провинция Дзилин, Китай (до X Fu).