Резюме

Заден план

Чревната микробиота играе решаваща роля за развитието на безалкохолен стеатохепатит (NASH). Точните механизми, чрез които измененията на чревната микробиота и нейния метаболизъм, допринасящи за патогенезата на NASH, все още не са изяснени напълно.

Методи

Мишките бяха хранени с наскоро докладван нов клас диета с високо съдържание на мазнини (HFD), индуцираща стеатохепатит HFD (STHD) -01 в продължение на 9 седмици. Съставът на чревната микробиота се анализира чрез T-RFLP. Луминалният метаболом е анализиран с помощта на капилярна електрофореза и течна хроматография време-полетна масспектрометрия (CE- и LC-TOFMS).

Резултати

Мишките хранеха STHD-01, развила NASH-подобна патология в рамките на кратък период. Лечението с антибиотици предотврати развитието на NASH чрез STHD-01. Съставът на чревната микробиота и нейните метаболитни дейности бяха значително нарушени при мишките, хранени със STHD-01, и приложението на антибиотици нормализира тези промени. Идентифицирахме, че метаболитните пътища на наситени мастни киселини с дълги вериги и n-6 са значително променени от STHD-01. Трябва да се отбележи, че промените в чревния липидом, причинени от STHD-01, са медиирани от чревната микробиота, тъй като изчерпването на чревната микробиота може да обърне смущението на тези метаболитни пътища. Наситена дълговерижна мастна киселина, палмитинова киселина, която се натрупва в групата STHD-01, активира чернодробните макрофаги и стимулира експресията на TNF-α.

Заключения

Липидният метаболизъм от чревната микробиота, особено насищането на мастни киселини, влияе върху натрупването на мазнини в черния дроб и последващото чернодробно възпаление в NASH.

Заден план

Броят на пациентите с мастна чернодробна болест (FLD) непрекъснато се увеличава през последните години. FLD поради причини, различни от прекомерен прием на алкохол, се нарича безалкохолно FLD (NAFLD) [1]. При пациенти с NAFLD дисрегулацията на адипокините, инсулиновата резистентност и дислипидемията водят до натрупване на мазнини в черния дроб [2,3,4]. Активирането на клетки на Kupffer и чернодробните звездни клетки и липидната пероксидация предизвикват възпаление на черния дроб, като по този начин водят до развитието на неалкохолен стеатохепатит (NASH). Броят на пациентите с NAFLD и NASH в Япония е съответно над 10 милиона и 1 милион. По този начин се изисква да се разбере точния механизъм на действие и да се разработят по-добри терапевтични лечения за NAFLD и NASH.

Неотдавнашно проучване съобщава за нов клас HFD, известен като индуциращ стеатохепатит HFD (STHD) -01. Консумацията на STHD-01 насърчава развитието на NASH-подобна патология за кратък период от време [12]. Тъй като обаче STHD-01 е наскоро разработена диета, остава неясно дали тази диета влияе върху чревната микробиота и нейните метаболитни дейности, насърчавайки развитието на NASH, подобно на това на често използваните HFD. Следователно, в настоящото проучване, ние анализирахме изчерпателно промяната на състава на микробиотата на червата и неговите метаболитни дейности, както и потенциалните механизми, свързани с индуцираното от STHD-01 развитие на NASH-подобни симптоми.

Методи

Животни

SPF C57BL/6J мишки са били хранени с конвенционална СЕ-2 диета (CLEA Japan Inc., Токио, Япония) до 8-седмична възраст. Чревната микробиота се нормализира чрез размяна на постелки между клетките на всеки 2-3 дни в продължение на 2 седмици. От 8-седмична възраст мишките се хранят със STHD-01 (11% kcal/протеин, 72% kcal/мазнини и 17% kcal/безазотни екстракти; EA Pharma Co. Ltd., Kawasaki, Kanagawa) [12 ] за 9 седмици. Контролната група е хранена със стандартна диета (SD) (AIN-93G) (19% kcal/протеин, 12% kcal/мазнини и 69% kcal/екстракт без азот). В групата с изчерпана микробиота мишките, хранени с диета STHD-01, са лекувани с антибиотичен (Abx) коктейл (цефтазидим, Sigma-Aldrich, Токио, Япония; C3809-5G плюс метронидазол; Sigma-Aldrich M3761-25G, и двете 1 g/L) от 7 седмици до 17 седмици. Мишките бяха убити на седмица 17 с изофлуран (Mylan Inc., Нагоя, Япония) [13] и бяха взети проби от периферна кръв, чревни тъкани и черен дроб. Хистологичната оценка е извършена по сляп начин от хепатолог и двама патолози от Университетската болница Кейо, както е описано по-рано [14].

Измерване на маркери на болестта

Нивата на аспартат аминотрансфераза (AST) и аланин аминотрансфераза (ALT) бяха измерени с помощта на Spotchem EZ (Sp-4430, Arkrey USA Inc., MN). Нивата на трийодтиронин (T3), тироксин (T4) и моноцитен хемоаттрактант протеин (MCP) -1 бяха измерени с ензимно свързан имуносорбентен комплект за анализ (T3 и T4, Alpha Diagnostic Intl. Inc., Antonio, TX. MCP-1, R&D System, Inc., Минеаполис, MN). За измерване на триглицеридите (TG) в чернодробната тъкан към всяка проба от чернодробна тъкан (0,1 g) се добавя разтвор на Folch (2: 1 хлороформ: метанол; Wako Pure Chemical Industries Ltd., Токио, Япония; 4 ml), която след това беше хомогенизирана. След добавяне и смесване с 0,5% NaCl (1 ml), сместа се центрофугира при 180 g при 20 ° С в продължение на 20 минути. Долният слой беше получен и изсушен под вакуум и след това към утайката беше добавен 1 mL изопропанол (Wako Pure Chemical Industries Ltd.). Нивата на TG са измерени с помощта на Pureauto S TG-N (Sekisui Medical Co., Ltd., Токио, Япония). На 15-та седмица мишките са гладували 1 ден преди измерването на нивата на кръвната захар на гладно. Нивата на кръвната глюкоза на гладно са измерени с GT-1640 (Arkrey USA Inc.). Плазмените нива на инсулин са измерени с набор за анализ на имуносорбентен инсулинов миши (Shibayagi Co., Ltd., Gunma, Япония).

Микробиомен анализ

На 17-та седмица се получават изпражнения от мишките и се суспендират отново във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) (0,1 g/ml). Фекалната суспензия беше смачкана с помощта на Bug Crashar (Taitec GM-01, Saitama, Япония) при максимално въртене за 10 минути. Пробата се инкубира върху лед за 5 минути и се центрофугира при 2300 g при 4 ° С за 1 минута. Супернатантата (500 μL) се поставя в друга епруветка и се завихря със 100 μL 10% SDS и 500 μL фенол/хлороформ/изоамилалкохол. След това пробата се центрофугира при 20 000 g при 20 ° С в продължение на 3 минути. Супернатантата се третира с хлороформ/изоамилалкохол и след това само с изоамилалкохол и ДНК пелетата се ресуспендира в 100 μL трис/етилендиамин тетраоцетна киселина буфер (TE) (Sigma) и 0,5 μL RNase A (Qiagen, Hilden, Германия). ДНК беше пречистена допълнително с помощта на комплекта за подготовка на шаблони (Roche, Базел, Швейцария).

Получената ДНК се анализира чрез анализ на полиморфизъм на дължина на крайния рестрикционен фрагмент (TechnoSuruga Laboratory Co., Ltd., Shizuoka, Япония). ДНК се амплифицира с маркирани с флуоресценция праймери и след това амплифицираната ДНК се третира с рестрикционния ензим BS/I (Takara Bio Inc., Токио, Япония) и се анализира с помощта на ABI Prism 3130xl DNA Sequencer (Applied Biosystems, CA) и Генен картограф (Приложни биосистеми). Клъстерният анализ беше извършен с използване на Gene Maths (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Белгия).

За измерване на общия брой чревни бактерии във фекалиите се използва стандартна крива Ешерихия коли геномна ДНК (JCM1649T, любезно предоставена от RIKEN, Сайтама, Япония) е изтеглена и вмъкната във векторната система pGEM®-T EASY (Promega Co., WI). ДНК-пробата се амплифицира с праймери 8F (5 'AGAGTTTGATYMTGGCTCAG 3') и 1510R (5 'TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3'). Количествена полимеразна верижна реакция (qPCR) беше извършена с помощта на SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Количественото определяне беше извършено с помощта на CFX96Touch ™ (Applied Biosystems). Стъпката на цикъла беше 50 ° C × 2 минути, 95 ° C × 10 минути, (95 ° C × 30 s, 60 ° C × 30 s, 72 ° C × 1 мин) × 50 цикъла.

Количествена RT-PCR

Екстракцията на РНК от черния дроб и чревните тъкани се извършва в съответствие с описания по-рано метод [15], като се използва Isogen (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). РНК се транскрибира в cDNA с помощта на комплект за обратна транскрипция на cDNA с висок капацитет (Applied Biosystems) и qPCR се извършва с помощта на SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Количественото определяне беше извършено с помощта на CFX96Touch ™ (Applied Biosystems). Стъпката на цикъла беше 50 ° C × 2 минути, 95 ° C × 10 минути, (95 ° C × 30 s, 60 ° C × 30 s, 72 ° C × 1 min) × 50 цикъла. Използваните грундове са обобщени в допълнителен файл 1.

Луминален метаболомен анализ

Подготовка на чернодробни клетки

Черен дроб CD11b + мононуклеарни фагоцити ex vivo култура

Чернодробни CD11b + мононуклеарни фагоцити се отделят от всички останали мононуклеарни фагоцити, използвайки MicroBeads (Miltenyi Biotec K.K., Япония). След това отделени CD11b + клетки се култивират в RPMI1640, съдържащ 0,1% пеницилин/стрептомицин (Sigma), допълнен с 10% фетален говежди серум (Biowest SAS, Nualle, Франция) със или без 200 μM палмитинова киселина (PA; Wako). След инкубация в продължение на 20 часа, иРНК се събира от CD11b + клетките, използвайки Isogen.

Статистически анализ

Резултатите бяха показани като средни ± стандартни грешки. Еднопосочен ANOVA, последван от post-hoc теста на Tukey, беше използван за сравнения на много групи. Ман-Уитни U-тестът е използван за сравнения на две групи. Всички сравнения бяха двустранни и a P-стойност

Резултати

STHD-01 индуциран стеатохепатит чрез промяна на чревната микробиота

микробиота-медиирана

Метаболитните дейности на чревната микробиота бяха драстично променени при мишките, хранени със STHD-01

Чревен микробиом и луминални метаболомични анализи при NASH мишки. а Получени са пресни фекални проби от всяка група мишки (н = 7) на седмица 17. Микробна. ДНК се извлича от изпражненията и се анализира чрез T-RFLP. Посочено е изобилието от бактериален род. Общият брой на бактериите (/ g изпражнения) е показан в горната част на всяка колона. Граничната стойност на общия брой бактерии е 1,0 × 10 6/g изпражнения (б) На 17-та седмица бяха получени пресни фекални проби от всяка група мишки (3 отделни мишки) и бяха анализирани с помощта на капилярна електрофореза време-полетна масспектрометрия (CE-TOFMS) и течна хроматография TOFMS (LC-TOFMS). Йерархичният клъстер анализ е показан с топлинна карта на метаболита

Наситените мастни киселини с дълга верига стимулират възпалението на черния дроб чрез активиране на мигриращи макрофаги в черния дроб

Дискусия

Чревната микробиота играе критична роля в патогенезата на NASH [21]. Тук ние анализирахме изчерпателно въздействието на храненето на нов клас HFD, STHD-01, върху чревната микробиота и последващото развитие на стеатохепатит. Както се съобщава по-рано при конвенционалните HFD, храненето със STHD-01 индуцира значителни промени в чревния микробен състав и последващите луминални метаболитни профили. Изчерпването на чревната микробиота чрез лечение на Abx значително подобрява STHD-01-индуцирания мал-метаболитен профил в червата и отслабва възпалението на черния дроб. Настоящото ни проучване подчерта ролята на дълговерижната наситена мастна киселина, PA, която се натрупва поради индуцирана от STHD-01 дисбиоза, в индуцирането на възпаление на черния дроб (Фиг. 5).

Редуване на наситените мастни киселини от чревната микробиота. Диаграма на настоящото проучване. При хранене на STHD-01, ненаситените мастни киселини (FA) се метаболизират до наситени FA (SFA) от чревната микробиота. SFA се абсорбират от червата и се натрупват в черния дроб. Натрупването на SFA в черния дроб ще стимулира възпалението на черния дроб. От друга страна, изчерпването на чревната микробиота от антибиотици води до по-ниски нива на генериране и усвояване на SFA в и от червата. Следователно натрупването на мазнини и възпалението в черния дроб се отслабват при лекуваните с антибиотици мишки

Заключения

Чревната микробиота и нейният липиден метаболизъм играят централна роля в патогенезата на NASH, индуцирана от нов STHD-01, индуциращ стеатохепатит. Изчерпателните експерименти, които използват мулти-OMICS „сухи“ анализи (чревен микробиом и метаболомен анализ), заедно с „мокри“ имунологични подходи ще ни позволят да разберем точните механизми на развитие на това заболяване. Насочването на чревната микробиота за промяна на метаболизма на мастните киселини може да бъде нов превантивен или терапевтичен подход при NAFLD и NASH.