Резюме

Оста на червата и мозъка е от голямо значение за контрола на енергийната хомеостаза. Идентифицирането на урогуанилин (UGN), пептид, освободен в червата, който се регулира от хранителния статус и аноректичните действия, като ендогенния лиганд за рецептора на гуанилил циклаза 2С разкри нова система за регулиране на енергийния баланс. Ние показваме, че хроничната централна инфузия на UGN намалява наддаването на тегло и затлъстяването при индуцирани от диета затлъстели мишки. Тези ефекти са независими от приема на храна и включват специфични еферентни автономни пътища. От една страна, мозъчната UGN предизвиква термогенеза на кафява мастна тъкан, както и покафеняване и мобилизиране на липиди в бяла мастна тъкан чрез стимулиране на симпатиковата нервна система. От друга страна, мозъчната UGN увеличава фекалната продукция през блуждаещия нерв. Тези открития са от значение, тъй като предполагат, че полезните метаболитни действия на UGN чрез симпатиковата нервна система не включват нежелани стомашно-чревни неблагоприятни ефекти, като диария. Настоящата работа предоставя механистични прозрения за това как UGN влияе върху енергийната хомеостаза и предполага, че действието на UGN в мозъка представлява осъществима фармакологична цел при лечението на затлъстяването.

тегло

Въведение

След поглъщане на храна, присъствието на хранителни вещества в стомашно-чревния тракт (GI) инициира сложни невронни и хормонални реакции, които изпращат сигнали до мозъка за текущите промени в хранителния статус. Сред различните стратегии, използвани за комуникация с мозъка, червата секретира пептиди, които достигат до централната нервна система (ЦНС) чрез аферентни нервни влакна или кръвообращението (1,2). Непрекъснато се откриват нови чревни хормони и, с изключение на грелина, който е единственият пептиден хормон, благоприятстващ наддаването на тегло и затлъстяването, всички те са свързани с отрицателен енергиен баланс и следователно са потенциални цели за лечение на затлъстяването (3, 4).

Един от най-скоро откритите чревни хормони е урогуанилин (UGN), 16-аминокиселинен пептид, секретиран главно от дуоденални епителни клетки. UGN се синтезира като прохормон (pro-UGN), който след разцепване от все още неизвестен ензим се превръща в активен UGN (3,5). Както про-UGN, така и UGN активират рецептора на гуанилат циклаза 2C (GUCY2C), който също е насочен от диареагенни бактериални топлинно стабилни ентеротоксини (ST) (6). Активирането на GUCY2C води до повишени вътреклетъчни нива на цикличен гуанозин монофосфат (7), което при безгръбначни видове е доказано, че води до промени в поведението на храните и регулирането на енергийния баланс (8,9). Циркулиращите нива на UGN са намалени при гладни и с липса на лептин мишки, но се възстановяват след повторно хранене или екзогенна инфузия на лептин (10), което предполага, че UGN се регулира от хранителния статус в зависимост от лептина.

Предишно проучване (11) предлага, че активирането на GUCY2C също е от значение при регулирането на енергийния баланс при бозайниците. При мишки про-UGN се освобождава от червата веднага след приема на хранителни вещества и се превръща в активен UGN в рамките на хипоталамуса, като по този начин активира GUCY2C и намалява приема на храна (11). В съгласие с тези резултати, фармакологичната стимулация на GUCY2C инхибира храненето при затлъстели мишки и мишки без GUCY2C са хиперфагични и по-склонни да развият метаболитен синдром (11).

Въпреки първоначалния ентусиазъм за UGN, тези нови и обещаващи открития бяха оспорени наскоро от друг доклад (12), посочващ, че централната администрация на UGN или ST не променя приема на храна или телесното тегло при слаби плъхове и че нокаутиращите мишки GUCY2C не присъстват вариации в телесното тегло или метаболизма на глюкозата в сравнение с дивия тип (WT) мишки. Всъщност този доклад (12) установява само умерено увеличение на телесното тегло, затлъстяване и непоносимост към глюкоза, когато мишките с дефицит на UGN са били хранени с диета с високо съдържание на мазнини (HFD).

Тъй като точната роля на UGN в регулирането на енергийната хомеостаза е противоречива и фармакологичната ефективност на UGN при затлъстяване остава неизвестна, целта на настоящата работа беше следната:

1) да проучи дали хроничното излагане на UGN е ефективно фармакологично лечение на затлъстяването чрез действията си върху важни параметри в енергийната хомеостаза, като прием на храна, разход на енергия или разделяне на хранителни вещества и

2) за дисекция на молекулярните основи, участващи в метаболитното действие на UGN.

Изследователски дизайн и методи

Животни и диети

Лечения и операции

Мишките бяха упоени чрез интраперитонеална инжекция на кетамин (8 mg/kg телесно тегло) и ксилазин (3 mg/kg телесно тегло). Интрацеребровентрикуларните канюли са имплантирани стереотаксично на мишки, както е описано по-рано (16). Животните са получили интрацеребровентрикуларно приложение на носител (физиологичен разтвор), α – меланоцит-стимулиращ хормон (MSH; 3 µg/мишка; Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО) или UGN (10 или 25 μg/мишка; Bachem, Bubendorf, Швейцария ). За да оценим хроничните централни ефекти на UGN, ние свързахме катетър от канюлата на мозъчната инфузия към осмотичен модератор на потока от микропомпа (25 µg/мишка/ден). Използвайки тъпа дисекция, създадохме подкожен джоб на гръбната повърхност, където поставихме осмотичната микропомпа (модел 1007D ALZET осмотични помпи; Durect, Купертино, Калифорния). Тези помпи са имали дебит от 0,5 µL/h по време на 7 дни лечение. След операцията мишките бяха зашити и държани на топло, докато се възстановят напълно. За периферни лечения мишките получават интраперитонеално приложение на UGN (25 ug/мишка).

Хирургическа ваготомия (VGX) е извършена, както е описано по-рано (17,18). Под кетамин-ксилазинова анестезия мишките бяха поставени по гръб и беше направен средна коремна инцизия. След това черният дроб беше внимателно преместен надясно, излагайки хранопровода. Гръбните и вентралните клонове на блуждаещия нерв бяха изложени и дисектирани от хранопровода. Всеки клон на нерва се лигира с хирургически конци в две точки възможно най-дистално, за да се предотврати кървенето и след това се каутеризира между конците. След това коремните мускули и кожата бяха зашити с хирургическа коприна. Правени са и фиктивни операции, при които всеки ствол на нерва е бил открит, но не е обвързан или каутеризиран. Ефективността на VGX е оценена 3 седмици след операцията чрез постмортно наблюдение на стомаха, с очевидно увеличение на размера на стомаха след VGX (поради двигателна дисфункция) като показател за успеха на терапията (данните не са показани). В анализа бяха включени само мишки с успешна терапия. Осмотични минипомпи и интрацеребровентрикуларни канюли са имплантирани 2 седмици след VGX.

Фармакологичното инактивиране на β3-AR се извършва чрез подкожно приложение на специфичния антагонист SR59230A (Tocris Bioscience) в доза от 3 mg/kg (19).

Състав на тялото и непряка калориметрия

Съставът на тялото (мастната маса) се оценява с помощта на система за ядрено-магнитен резонанс (анализатор на състава на цялото тяло; EchoMRI, Хюстън, Тексас). Измерванията са извършени преди операцията и в последния ден от лечението. По време на интрацеребровентрикуларното лечение за период от 7 дни, мишките бяха анализирани за енергиен разход, дихателен коефициент (RQ) и двигателна активност с помощта на калориметрична система (LabMaster; TSE Systems) (16).

Екстракция на протеини и Western Blot

Истоморфология

За да изследваме хистоморфологичната структура на НДНТ и WAT, извършихме оцветяване с хематоксилин-еозин в тъканни секции. Накратко, пробите BAT и WAT бяха фиксирани за 24 часа в 10% формалинов буфер и след това бяха дехидратирани и вградени в парафин, използвайки стандартна процедура. Разрези от 3 μm бяха направени с микротом и оцветяването беше извършено със стандартна процедура за хематоксилин/еозин алкохол (Bio-Optica), следвайки инструкциите на производителя (20). Секции бяха наблюдавани и фотографирани с помощта на микроскоп Provis AX70 (Olympus, Токио, Япония). Цифровите изображения за НДНТ са количествено определени със софтуера ImageJ (Национален здравен институт).

Имунохистохимия

Детекцията на UCP1 в НДНТ и WAT беше извършена с помощта на анти-UCP1 (1: 500; Abcam, Cambridge, UK), както беше описано по-рано (19). Изображенията са заснети с цифров фотоапарат XC50 (Olympus).

PCR в реално време

РНК беше изолирана от мастната тъкан с помощта на TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA), съгласно инструкциите на производителя (18). Екстрахираната обща РНК се пречиства с обработка с DNase, като се използва комплект без ДНК като шаблон (Ambion; Thermo Fisher Scientific, Grand Island, NY), за да се генерират cDNAs от първа верига, използвайки комплект за обратна транскрипция на cDNA с голям капацитет (Applied Biosystems, Foster Град, Калифорния). Количествената PCR в реално време се извършва с помощта на инструмент StepOnePlus (Applied Biosystems) със специфични количествени RT-PCR праймери TaqMan и сонди. Специфичните за олигонуклеотидите праймери са изброени в Допълнителна таблица 1. За анализ на данните като ендогенна контрола е използван хипоксантин фосфорибозилтрансфераза и нивата на експресия в групата на пробата са изразени спрямо средната стойност на контролната група.