Резюме

Заден план

Честата консумация на диета с високо съдържание на мазнини и захароза допринася за заболявания, свързани с начина на живот. Налична е обаче ограничена информация относно краткосрочните ефекти на такава диета върху появата на свързани със затлъстяването метаболитни аномалии.

Методи

Мъжки мишки C57BL/6 J бяха разделени на две групи и хранени със стандартна диета с чау (контролна група) или диета с високо съдържание на мазнини и захароза, съдържаща 21% мазнини и 34% захароза (HF-HS диетична група) за 2 или 4 седмици.

Резултати

Диетата HF-HS значително индуцира наддаване на телесно тегло, започвайки от седмица 1 и подобно увеличава теглото на мезентериалната бяла мастна тъкан и нивата на инсулин в плазмата на седмици 2 и 4. Нивата на плазмен резистин са значително повишени след хранене с диетата HF-HS в продължение на 4 седмици. Измерването на чернодробните триглицериди и оцветяването с маслено червено О ясно показва повишено натрупване на чернодробни липиди в отговор на диетата HF – HS още в рамките на 2 седмици. Количественият PCR анализ на черния дроб и бялата мастна тъкан показва, че, започвайки от седмица 2, HF-HS диетата регулира експресията на mRNA от гени, участващи в липидния метаболизъм и възпаление и понижени гени, участващи в инсулиновата сигнализация. Въпреки че нивата на холестерол в плазмата също бързо се повишават от HF-HS диетата, не са открити разлики между контролните и HF-HS диети хранени животни в експресията на ключови гени, участващи в биосинтезата на холестерола.

Заключения

Нашето проучване показва, че бързото начало на хепатостеатоза, хипертрофия на мастната тъкан и хиперинсулинемия чрез поглъщане на диета с високо съдържание на мазнини и захароза може да се дължи на бързата реакция на липогенни, инсулинови сигнали и възпалителни гени.

Заден план

Наднорменото тегло или затлъстяването е един от водещите рискове за смърт в световен мащаб. Все повече доказателства показват, че затлъстяването е свързано с множество съпътстващи заболявания като диабет тип 2, хипертония, хиперхолестеролемия, хипертриглицеридемия и безалкохолно мастно чернодробно заболяване [1–3]. Изчислено е, че 20–25% от възрастното население на света има метаболитен синдром, свързан със затлъстяването и те са два пъти по-склонни да умрат и три пъти по-вероятно да получат инфаркт или инсулт в сравнение с хора без синдром [4, 5 ]. Освен обезогенната среда и намалените енергийни разходи по време на работа и развлечения, една от основните причини за настоящата епидемия от затлъстяване и свързаните с това метаболитни нарушения е свързана с диетата в западен стил, която включва прекомерен прием на високо съдържание на мазнини и захароза храни. Няколко проучвания са оценили дългосрочно (над 10 седмици

2 години) ефекти на диетите с високо съдържание на мазнини и/или захароза върху метаболитните рискови фактори [6–8]. От друга страна, налична е ограничена информация за краткосрочните ефекти на диетата с високо съдържание на мазнини и захароза (HF – HS) върху началото на хепатостеатозата и промените в експресията на гени, участващи в метаболизма на липидите и холестерола, инсулиновата сигнализация, и възпаление в черния дроб и бялата мастна тъкан (WAT).

Черният дроб и WAT са важни за метаболитната регулация. Като последици от затлъстяването, мастната чернодробна и адипоцитна хипертрофия играят решаваща роля в развитието на метаболитен синдром чрез множество механизми, включително нарушена инсулинова сигнализация и възпаление [9, 10]. За да се разберат по-добре влиянията на диета в западен стил с високо съдържание на мазнини и захароза върху появата на метаболитни аномалии, свързани със затлъстяването, настоящото проучване е предназначено да оцени краткосрочните (2 и 4 седмици) ефекти на СН HS диета за рисковите фактори за метаболитни нарушения. Следователно ние изследвахме основния механизъм при мишки C57BL/6 J, инбреден миши щам, който се използва за проучвания на затлъстяване и диабет поради неговата чувствителност към тези заболявания в отговор на диета с високо съдържание на мазнини [11, 12].

Методи

Животни

Това проучване е одобрено от институционалния комитет за грижи и употреба на животните в Kitayama Rabesu Inc. (Нагано, Япония), където животните са били настанявани през целия експериментален период. Осемседмични мъжки мишки C57BL/6 J (Charles River Laboratories, Inc., Канагава, Япония) бяха настанени в стая при 23 ± 1 ° C с 12/12-часов цикъл светлина-тъмнина.

Диети

Мишките бяха хранени с две различни диети. Диетата с ниско съдържание на мазнини и ниско ниво на захароза е стандартна чау-чау за мишки CRF-1 (Oriental Yeast Co. Ltd., Tokyo, Japan). Съставът му беше (тегло/тегло): 5,4% мазнини, 53,8% въглехидрати, 21,9% протеини, 2,9% фибри, 6,6% минерали, добавени витамини А, D и Е и 0,02% холестерол (357 kcal на 100 g). Диетата HF – HS е диета на основата на млечни мазнини (TD.88137; Harlan Laboratories Inc., Indianapolis, IN, USA). Съставът му е бил (тегло/тегло): 21,2% мазнини, 49,1% въглехидрати (34,1% захароза плюс 15% царевично нишесте), 17,3% протеин, 5,0% фибри, 3,5% минерали, 0,4% CaCO3, 1% витаминен микс, 0,004% антиоксиданти и 0,2% холестерол. Мазнините осигуряват 42% от калориите, а диетата дава 450 kcal на 100 g.

Експериментален протокол

Животните имаха свободен достъп до вода и стандартна чаша за мишки CRF – 1 за период на аклиматизация от 1 седмица. След това животните с тегло 23–24 g бяха разпределени на случаен принцип в две групи за експеримента за хранене. Контролната група (n = 12) е хранена със стандартна миша чау CRF-1, а групата HF-HS (n = 12) е хранена с диетата TD.88137, която е с високо съдържание на мазнини и захароза. По време на проучването се проследяват телесното тегло и приема на храна. В края на 2 седмици и 4 седмици мишките (контролната група, n = 6; HF-HS диетична група, n = 6) бяха упоени с 4% натриев пентобарбитал (Dainippon Sumitomo Pharma, Осака, Япония). Пълна кръв се събира от коремната аорта в епруветки, покрити с EDTA, и се получава плазма чрез центрофугиране при 3000 об/мин за 15 минути при 4 ° С и се съхранява при -80 ° С до биохимичен анализ. Чернодробният и мезентериалният WAT се дисектират и претеглят след кратко измиване със студен фосфатно буфериран физиологичен разтвор (рН 7,4). Органите незабавно се замразяват бързо в течен азот и се съхраняват при -80 ° C до по-нататъшна екстракция на липиди и анализ на количествена полимеразна верижна реакция (QPCR). Чернодробните порции бяха фиксирани в 10% формалин за хистологично изследване.

Биохимичен анализ на плазмата

Плазмените триглицериди, свободните мастни киселини, общият холестерол и липопротеиновият холестерол с висока плътност (HDL-C) се определят ензимно, като се използват търговски налични комплекти реагенти (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Осака, Япония). Липопротеиновият холестерол с ниска плътност (LDL-C) се изчислява като общ холестерол - HDL-триглицерид × 0,2.

Плазмените концентрации на инсулин и адипокини, които имат широкообхватни ефекти върху енергийния прием/разход, както и върху въглехидратния и липидния метаболизъм, са измерени чрез ензимно-свързани имуносорбентни анализи (ELISA). Комплект за миши инсулин ELISA (Morinaga Institute of Biological Science, Inc., Йокохама, Япония), Комплект за мишка Adiponectin ELISA (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Токио, Япония) и Комплект ELISA за миши резистин (Shibayagi Co. Ltd., Gunma, Япония) са използвани за определяне на плазмените нива на тези протеини.

Екстракция и анализ на съдържанието на чернодробни липиди

Екстракцията на общите липиди от част от черния дроб се извършва, както е описано от Folch и др.[13] в присъствието на бутилиран хидрокситолуен като антиоксидант. Екстрахираните липиди се сушат с помощта на вакуумен концентратор (Concentrator Plus 5305, Eppendorf) и се разтварят в 2-пропанол. Концентрациите на триглицеридите и общия холестерол бяха определени с помощта на търговски ензимни комплекти (Wako). За чернодробната хистология фиксираната с формалин чернодробна тъкан се вгражда в парафин, нарязва се на 10-μm участъци и се оцветява с хематоксилин и еозин. Маслено червено O (Sigma Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) оцветяване на неутрални липиди беше направено върху замразени секции.

Обща РНК се извлича от замразен черен дроб и WAT, като се използва системата за изолация на SV Total RNA (Promega Corp., Madison, WI, USA), съгласно инструкциите на производителя. Концентрацията и чистотата на РНК се оценяват въз основа на абсорбцията при 260 nm и 280 nm. СДНК от първа верига се синтезира от обща РНК, като се използва комплект за синтез на 1-верижна кДНК PrimeScript II (TaKaRa Bio, Otsu, Япония), като се използват олиго dT-адаптерни праймери и 1 μg обща РНК като шаблон. Получената сДНК се използва за QPCR амплификация в 96-ямков формат със SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa Bio) и система за PCR в реално време 7500 (Life Technologies Co., Япония). Нивата на експресия на тестовите гени бяха нормализирани до експресията на домакинския ген, кодиращ 18 S рибозомна РНК. Грундовете, използвани за QPCR, са изброени в Таблица 1.

Статистически анализ

Данните са представени като средната стойност ± SE. Всички статистически тестове бяха извършени с помощта на Student's т-тест и статистическата значимост се счита за P

Резултати

Тегло на тялото, WAT и черния дроб

Мишките от групата на диетата с HF-HS бързо напълняват. Както е показано на фигура 1, диетата HF – HS увеличава телесното тегло с 8,3% (P Фигура 1

мазнини

Плазмен липиден профил

Както е показано на фигура 2, диетата HF-HS увеличава общия холестерол със 103,8% (P Фигура 2

Плазмени нива на инсулин и адипокини

Както е показано на фигура 3, диетата HF-HS е причинила 2,2-кратно и 1,1-кратно увеличение (P Фигура 3

Липидно натрупване в черния дроб

Въпреки че разликата в чернодробния холестерол между животните, хранени с контрола и HF-HS диетите не достига статистическа значимост, HF-HS диетата повишава нивата на чернодробните триглицериди със 135% (P Фигура 4

Експресия на ключови гени, участващи в метаболизма на липидите и холестерола и инсулиновата сигнализация в черния дроб

Експресията на гени, тясно участващи в липогенезата и липидния транспорт, бързо се регулира при животни, като се има предвид диетата HF-HS (Фигура 5А). На седмица 2 и седмица 4, съответно, HF-HS диетата увеличава експресията на mRNA на чернодробния X рецептор алфа (LXRα) с 2,4 пъти (P Фигура 5

Експресия на гени, свързани с липидния метаболизъм и възпаление в WAT

Както е показано на Фигура 6А, диетата HF-HS бързо регулира експресията на гени, участващи в липогенезата в мезентериалната WAT. През съответните седмици 2 и 4, HF-HS диетата увеличава експресията на иРНК на SREBP1c с 3,3 пъти и 1,4 пъти (P Фигура 6

Дискусия

В това проучване ние демонстрирахме, че краткосрочното хранене с HF-HS диета е повишило телесното и WAT теглото и чернодробната стеатоза още за 2 седмици. Калориите в HF-HS диетата са с 26% по-високи от тези в стандартната чау (контрол). Въпреки че няма разлика в приема на храна между животните при контрола и HF-HS диета, дневният прием на калории се увеличава от HF-HS диетата. По този начин може бързо да настъпи висцерално затлъстяване и затлъстяване на черния дроб с прием на висококалорична диета с високо съдържание на мазнини и захароза.

След хранене с HF-HS диета, едновременно с понижаване на IRS2 Akt2, и AMPK които участват в инсулиновия сигнален път в черния дроб, плазмените нива на инсулин са били повишени по подобен начин на 2 и 4 седмици, което предполага, че нарушената инсулинова сигнализация се е задействала бързо в отговор на HF-HS диетата. Повишеното затлъстяване и натрупването на чернодробни липиди са тясно свързани с инсулиновата резистентност [31]. Вътреклетъчното натрупване на диглицериди води до активиране на протеин киназа С, което от своя страна намалява стимулираното от инсулин фосфорилиране на тирозин IRS-1/IRS-2, активирането на фосфоинозитид-3 киназа и сигнализирането за инсулин надолу по веригата [32]. Хроничното излагане на фруктоза причинява хиперинсулинемия и затлъстяване чрез променени механизми, които включват ефекта на фруктоза върху изчерпването на АТФ и генерирането на пикочна киселина [33], повишени нива на циркулиращ С-пептид, които често са свързани с инсулинова резистентност [34], участие на транспорта на фруктоза GLUT5, който показва значително по-високи нива на експресия при млади плъхове със затлъстяване Zucker в сравнение с постните контроли [35], и хипотезата за хексозамин, при която се смята, че хексозаминовият поток участва в регулирането на глюкозните пътища [36].

Заключения

В заключение, настоящото проучване демонстрира, че поглъщането на диета с високо съдържание на мазнини и захароза от мишки значително повишава теглото на WAT, чернодробната стеатоза и плазмените нива на инсулин още 2 седмици. Експресията на гени, участващи в многократните стъпки на натрупване на липиди и възпаление в черния дроб и WAT се увеличава бързо в отговор на HF-HS диетата и експресията на тези генни продукти може да допринесе за бързото натрупване на липиди в тези органи и може да има допълнителни нарушена чернодробна инсулинова сигнализация, водеща до компенсаторна хиперинсулинемия.