Допринесе еднакво за тази работа с: Вирджини Лекомте, Надеем О. Каакуш

микробиота

Партньорско училище по медицински науки, UNSW Австралия, Сидни, Нов Южен Уелс, Австралия

Допринесе еднакво за тази работа с: Вирджини Лекомте, Надеем О. Каакуш

Партньорско училище по биотехнологии и биомолекулярни науки, UNSW Австралия, Сидни, Нов Южен Уелс, Австралия

Партньорско училище по медицински науки, UNSW Австралия, Сидни, Нов Южен Уелс, Австралия

Партньорско училище по медицински науки, UNSW Австралия, Сидни, Нов Южен Уелс, Австралия

Партньорско училище по биотехнологии и биомолекулярни науки, UNSW Австралия, Сидни, Нов Южен Уелс, Австралия

Партньорско училище по биотехнологии и биомолекулярни науки, UNSW Австралия, Сидни, Нов Южен Уелс, Австралия

Партньорско училище по медицински науки, UNSW Австралия, Сидни, Нов Южен Уелс, Австралия

  • Вирджини Лекомте,
  • Надеем О. Каакоуш,
  • Кристофър А. Малоуни,
  • Мукеш Райпурия,
  • Карина Д. Хуинао,
  • Хейзъл М. Мичъл,
  • Маргарет Дж. Морис

Фигури

Резюме

Първите доказателства за промяна в състава на микробиотата на червата в отговор на затлъстял фенотип са показани при генетични затлъстели ob/ob мишки; тези мишки показват по-малко Bacteroidetes и повече Firmicutes [8]. Освен това, идеята за обезогенна чревна микробна популация се появи, когато същите автори откриха, че фенотипът на затлъстяването може да се предаде чрез трансплантация на чревна микробиота при мишки [9].

Лей и колеги потвърдиха тези наблюдения при хора със затлъстяване [10], но точният характер на промяната в чревната микробиота, свързана със затлъстяването при хората, остава противоречив [11–14]. Няколко проучвания обаче показват връзки между бактериално богатство и индекс на телесна маса (ИТМ), затлъстяване, дислипидемия и инсулинова резистентност [15].

Съставът на чревната микробиота е силно повлиян от приемната среда [16,17]. Диетата е един от различните фактори, на които чревната микробиота реагира [18]. При животните диетата с високо съдържание на мазнини (HFD) води до променено изобилие на бактериодетите и фирмикутес фила [8,19–23]. Промени в отговор на HFD също са докладвани на нива на клас и ред, но доскоро техническите ограничения не позволяват изследване на по-дълбоко ниво, за да се даде възможност за идентифициране на значителни промени на ниво семейство или вид [24].

Чревната микробиота е потенциална терапевтична цел за метаболитни заболявания. Въпреки че диетичните интервенции могат да нормализират състава на чревната микробиота при лица с наднормено тегло и затлъстяване, са необходими по-целенасочени подходи [32]. Две основни стратегии, използвани за манипулиране на чревния микробен състав, са селективно стимулиране на растежа и активността на определени видове чрез прилагане или на пребиотици, или на хранителни добавки, които съдържат живи бактерии, пробиотици [33,34]. За да бъдат тези стратегии ефективни обаче, те трябва да бъдат насочени срещу специфични видове, участващи в развитието на метаболитния синдром. Към днешна дата повечето проучвания, които са анализирали чревната микробиота, свързана със затлъстяването, са докладвали само на ниво филум. В настоящото проучване използвахме 16S rRNA технология за секвениране с висока производителност, която за първи път при плъхове предостави наблюдения на промените в чревната микробиота в отговор на HFD на видово ниво. Освен това демонстрираме, че няколко промени в изобилието на видовете са в тясна корелация с влошаването на метаболитните параметри, свързани със затлъстяването, като по този начин подчертаваме ролята на тези специфични видове в развитието на затлъстяването и възможните терапевтични цели.

Материали и методи

Декларация за етика

Това проучване е проведено в строго съответствие с препоръките на Австралийския кодекс за грижа и използване на животните за научни цели (1969 г.), Закона за изследване на животните от 1985 г. и Регламент за изследване на животните от Новия Южен Уелс от 2010 г.

Всички процедури за животни са одобрени от Комитета по грижа и етика на Университета на Нов Южен Уелс (ACEC) (ACEC # 11/25A). Всички усилия бяха положени за минимизиране на страданията и стреса на животните. Евтаназията се извършва под дълбока анестезия, предизвикана от смес кетамин/ксилазин.

Грижа за животните

6-седмични мъжки плъхове Sprague Dawley от Центъра за изследване на животните (ARC, Пърт, Австралия) бяха настанени в чисто помещение, по 2 на клетка при 12:12 h цикъл светлина/тъмнина. След аклиматизацията плъховете бяха разделени на две групи с еднакво средно телесно тегло (n = 10/10). Контролните плъхове бяха хранени с контролна чау (11 kJ/g, 12% мазнини, 21% протеини, 65% въглехидрати като процент енергия; Gordon's Stockfeeds, NSW, Австралия), докато на HFD групата беше предложен избор от три различни диети: контролната чау, търговска диета с високо съдържание на мазнини SF03-020 (20 kJ/g, 43% мазнини, 17% протеини, 40% въглехидрати; Специални фуражи, Glen Forest, WA, Австралия) и модифицирана чау, състояща се от чау на прах, подсладено кондензирано мляко и наситени животински мазнини (свинска мас; 15,4 kJ/g; 51% мазнини, 10% протеини, 38% въглехидрати) за 16 седмици. Средният прием на храна за 24 часа се изчислява ежеседмично чрез внимателно събиране и претегляне на останалата храна в клетката и изваждане на това от даденото известно количество.

Тест за толерантност към глюкоза и инсулин

Тест за глюкозен толеранс е направен на 21-седмична възраст (13-седмична диета) след гладуване през нощта. Два g глюкоза/kg телесно тегло (30% w/v) се прилагат интраперитонеално на всеки плъх и се измерват концентрациите на глюкоза в кръвта при 0, 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минути с помощта на глюкоза Accu-check Go метър (Roche диагностика, Castle Hill, NSW, Австралия). Кръвни проби за измерване на инсулин се събират в епруветки, покрити с хепарин, на 0, 15, 30, 60 и 120 минути. Плазмените проби, получени след центрофугиране на кръвта, се съхраняват при -20 ° C.

Тест за инсулинов толеранс отново е направен на 22-седмична възраст, 6 часа след отстраняване на храната. Прилага се една IU/Kg телесно тегло инсулин (100 IU/ml Actrapid, NovoNordisk) и се измерват концентрациите на глюкоза в кръвта при 0, 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минути.

Вземане на проби

На 24-седмична възраст плъхове на гладно през нощта се тестват за кръвна захар, след което се анестезират (ксилазин/кетамин 15/100 mg/kg; Provet, Castle Hill, NSW, Австралия). След измерване на телесното тегло и назо-аналната дължина, кръв се събира в епруветки, покрити с хепарин, след сърдечна пункция. Кръвта се центрофугира при 13 000 rpm за 5 минути (Eppendorf Minispin; Crown Scientific, NSW, Австралия) и плазмата се съхранява при -20 ° C за измерване на хормони (лептин и инсулин) и триглицериди. Плъховете бяха убити чрез обезглавяване. Ретроперитонеалната и епидидималната бяла мастна тъкан (RpWAT; epiWAT) бяха дисектирани и претеглени. Една фекална проба от животно е събрана от крайната част на цекума и е съхранявана при -80 ° C преди изследването.

Анализи на плазмените триглицериди, лептин и инсулин

Плазмените триглицериди бяха анализирани колориметрично (490 nm; iMark Microplate Absorbance Reader, Bio-Rad, Gladesville, NSW, Австралия), като се използва търговски наличен триглицериден реагент (GPO-PAP, Roche диагностика, Castle Hill, NSW, Австралия) и глицеролов стандарт (Sigma, Castle Hill, NSW, Австралия). Концентрациите на плазмен лептин и инсулин бяха анализирани с помощта на предлаганите в търговската мрежа комплекти за радиоимуноанализ, съгласно инструкциите на производителя (Merck Millipore, Billerica, MA, USA) и отчетени на автоматичен брояч на гама WIZARD 2 (PerkinElmer, Melbourne, VIC, Australia). Резултатите бяха изразени като средна стойност ± SEM. Антропометричните и метаболитните параметри бяха анализирани чрез двустранен t-тест на Student след проверка на нормалността и трансформация на данни, когато е необходимо, с помощта на SPSS, версия 20 (SPSS Inc., Чикаго, САЩ).

ДНК екстракция и секвениране на микробна общност

ДНК екстракцията се извършва с помощта на ISOLATE Fecal DNA Kit (Bioline; Alexandria, NSW, Австралия) в съответствие с инструкциите на производителя. Концентрацията и качеството на ДНК се измерват с помощта на спектрофотометър Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies; Wilmington, САЩ).

Микробната общност беше оценена чрез високопроизводително секвениране на гена 16S rRNA. Кодирано с етикет FLX ампликон пиросеквениране (bTEFAP) се извършва, както е описано по-рано, като се използват праймерите Gray28F (5’TTTGATCNTGGCTCAG) и Gray519r (5 ’GTNTTACNGCGGCKGCTG) [35–38] с праймерите, номерирани по отношение на E. coli 16S rNA. Генерирането на секвенционната библиотека използва PCR в една стъпка с общо 30 цикъла, смес от Hot Start и HotStar taq полимерази с висока точност и ампликони, произхождащи и секвениращи, простиращи се от 28F със средна дължина на четене 400 bp. PCR се извършва при следните условия: 94 ° С за 3 минути, последвано от 30 цикъла от 94 ° С за 30 s; 60 ° C за 40 s и 72 ° C за 1 min; и краен етап на удължаване при 72 ° С за 5 минути. Кодираните с етикети FLX ампликонни пиросеквениращи анализи използват инструмент Roche 454 FLX с титаниеви реагенти. Този bTEFAP процес е извършен в лабораторията за молекулярни изследвания (MR DNA; Shallowater, TX) въз основа на установени и валидирани протоколи [35–38].

Данните за последователността Q25, получени от процеса на секвениране с висока производителност, бяха анализирани, използвайки тръбопровод, разработен в Molecular Research LP. Първоначално последователностите бяха изчерпани от баркодове и грундове, след това кратки последователности 97%, видове; между 97% и 95%, некласифицирани видове; между 95% и 90%, некласифициран род; между 90% и 85%, некласифицирано семейство; между 85% и 80%, некласифицирана поръчка; между 80% и 77%, некласифициран тип; Фигура 1. Телесно тегло по време на 16-седмичния диетичен експеримент.

Черната линия представлява плъховете на чау диета (n = 10); сивата линия представлява плъховете на диета с високо съдържание на мазнини (n = 10). Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. *** P Таблица 1. Метаболитни параметри след 16 седмици диета.

В съответствие с увеличената мастна маса, нивата на плазмен лептин са четири пъти по-високи при плъхове, хранени с HFD, в сравнение с контролните плъхове (P Фиг. 2. Глюкозен толеранс и инсулинова чувствителност.

а) Тест за толерантност към глюкоза след 13 седмици диета. Черната линия представлява плъховете на чау диета (n = 10); сивата линия представлява плъховете на диета с високо съдържание на мазнини (n = 10). б) Площ под кривата на GTT, изчислена на 90 минути. Черната кутия представлява плъховете на чау диета; сивата кутия представлява плъховете на диета с високо съдържание на мазнини. в) Тест за инсулинова толерантност след 14 седмици диета. г) Площ над кривата за ITT, изчислена на 120 минути. Резултатите са изразени като средна стойност ± SEM. * P Фиг. 3. Средно разнообразие между типовете диети, използвайки индекса на разнообразието на Шанън-Уивър (H) за всички таксономични нива.

Статистика за разнообразието: T-тест: df = 13 за фила (неравна дисперсия) и df = 18 за всички останали таксономични нива; U-тест на Manny-Whitney: df = 1. p (t) е P-стойност на t-теста, p (W) е P-стойност на U-теста на Mann-Whitney. Лентите за грешки показват стандартната грешка на средната стойност.

Анализ на промените в микробните общности

Проведен е предварителен анализ на принципния компонент (PCA), за да се визуализират разликите в състава на бактериалната фила между типовете диети и да се определи кои фили са най-силно свързани с наблюдаваните разлики. PCA потвърди, че пробите от плъхове, хранени с чау и HFD, образуват отделни клъстери в графика за ординация (S1 Фиг.). Това разделяне е най-очевидно по оста PC1, което обяснява 71,0% от общата вариация и за което Bacteroidetes и Firmicutes имат най-висока корелация (съответно 0,406 и -0,836) (S1 Фиг.). Оста PC2 обяснява 22,5% от общата вариация (S1 фиг.), Но не се правят разграничения между диетичните групи чрез този компонент.

Основната ос показва кумулативния принос, който всяка таксономична идентичност допринася за средното различие между видовете диети. Горните граници на показания принос са 100% от средното различие във филата, до 90% от средното различие в класа, реда и семейството и до 50% от средното различие в рода и видовете. Вторичната ос показва средното различие/стандартно отклонение (δ/SD) на всяка показана таксономична идентичност. Процентното различие в микробния състав между типовете диети е показано на всяка графика.

Микробните общности показват 37,53% различия на ниво поръчки. Подобно на нивото на класа,% кумулативният принос започва да се изравнява при Desulfovibrionales, ред в Deltaproteobacteria. Lactobacillales и Clostridiales доминират проби от плъхове, хранени с чау, докато HFD се свързва със значително по-ниско изобилие от Lactobacillales и по-голямо количество Clostridiales, Bacteroidales, Enterobacteriales, Erysipelotrichales и Desulfovibrionales (Фигура 4 и Таблица 2). Този модел е в съответствие с бактериалния състав на ниво клас, в който са представени тези поръчки

100% от съответното им изобилие на ниво клас (Таблица 2). От тези таксони Lactobacillales, Bacteroidales, Enterobacteriales и Desulfovibrionales имат най-високите δi/SD и следователно са по-добри дискриминатори между типовете диети (Фигура 4).

Различието отново се увеличи до 44,65% на семейно ниво, като% кумулативният принос започна да се изравнява при таксона Erysipelotrichaceae (Фиг. 4). Както се очакваше, Lactobacillaceae доминираха над микробиотата при плъхове при чау диета, което е вероятно да бъде свързано с по-ниското разнообразие на микробиотата при тези плъхове в сравнение с плъхове, хранени с HFD (Фигура 3). Това се подкрепя от значително по-ниското изобилие на Lactobacillaceae при плъхове, хранени с HFD (Таблица 2), както и по-голямото изобилие от други важни групи, включително Bacteroidaceae, Lachnospiraceae, Enterobacteriaceae, Ruminococcaceae, Veillonellaceae, Porphyromonadaceae и Erysipelotrichaceacearyaea. От тези таксони Veillonellaceae са имали най-високата стойност δi/SD и вероятно ще бъдат най-добрият дискриминатор между типовете диети на това таксономично ниво, най-вероятно поради липсата му при плъхове, хранени с чау.

Различията на микробните съобщества на ниво род и вид са съответно 46,5% и 53,71%. Процентният кумулативен принос започва да се изравнява при Parabacteroides и Bacteroidetes vulgatus съответно за рода и видовете (Фиг. 4 и S2 Фиг.). Отново, Lactobacillus и по-точно Lactobacillus intestinalis доминираха над микробиотата при плъхове, хранени с чау (фигура 4 и таблица 2). За разлика от тях, Lactobacillus intestinalis са значително по-ниски при плъхове, хранени с високомаслена диета, с по-голямо изобилие от други важни родове, включително Blautia, Morganella, Bacteroides, Phascolarctobacterium и Parabacteroides (Таблица 2). В рамките на тези родове видовете, които представляват интерес са Blautia producta, Morganella morgani, Phascolarctobacterium некласифициран, Bacteroides fragilis, Parabacteroides distasonis и Bacteroides vulgatus (Таблица 2). От тези таксони Phascolarctobacterium има най-високата стойност δi/SD, отново най-вероятно поради липсата му при плъхове, хранени с чау (Таблица 2). Като цяло се наблюдават различни профили на общността между типовете диети на всички таксономични нива и значително по-голямо разнообразие се наблюдава при плъхове, хранени с HFD, на ниво тип, семейство, род и вид (Фигура 5).

Тези таксони допринасят за 100% от средното различие във филата, до 90% от средното различие в класа, реда и семейството и до 50% от средното различие в рода и видовете, както е показано в графиките SIMPER (Фигура 4).

Корелация на микробното изобилие с метаболитните параметри

Извършени са корелации на изобилието на бактерии с измервания на седем метаболитни параметъра, свързани със затлъстяването, за всички плъхове за таксони, допринасящи най-много за различието между диетичните групи (Фигура 6). Тестваните параметри са: Промяна в телесното тегло, мастната маса при убийството, лептин, инсулин и триглицеридни плазмени концентрации, глюкозен толеранс, изразен чрез AUC GTT и инсулинова чувствителност, изразена от AAC ITT.

Тематични области

За повече информация относно предметните области на PLOS кликнете тук.

Искаме вашите отзиви. Имат ли смисъл тези предметни области за тази статия? Щракнете върху целта до неправилната тема и ни уведомете. Благодаря за вашата помощ!

Е тематичната област "Диета" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Чревни бактерии" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Затлъстяване" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Мастна тъкан" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Телесно тегло" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Инсулин" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Лактобацилус" приложим за тази статия? да не

Благодаря за отзивите ви.

Е тематичната област "Стомашно-чревния тракт" приложим за тази статия? да не