Резюме

При животните дезоксиниваленол (DON) причинява повръщане, отказ от фураж, забавяне на растежа и засяга имунната система. DON е често срещан замърсител на пшеницата, но валидирани данни за биомаркери за оценка на експозицията на индивидуално ниво и следователно липсват всякакви свързани здравни ефекти. Разработването на силно надежден анализ за DON в урината, включващ почистване на имуноафинитет (IAC) и откриване на течна хроматография (LC) -маса спектрометрично (MS), позволи оценката на (1) експозиция на DON в лица от Обединеното кралство и (2) пшеница приемна интервенция на нивата на DON в урината. Двадесет и пет доброволци от Обединеното кралство (на възраст 21–59 години) попълниха полупретеглени дневници за храна на 1 и 2 ден (нормална диета), а на 3 ден беше предоставена сутрешна проба от урина. На 3–6 дни (намеса), хората ограничиха основните източници на прием на пшеница след диетични указания. Дневниците бяха завършени на 5 и 6 ден, а допълнителна сутрешна урина беше предоставена на 7 ден. DON на урината беше измерена след почистване и анализ на IAC от LC-MS. Приемът на храна на базата на пшеница (средно 322 g/ден, диапазон: 131–542 g/ден), е значително (P

Въведение

Методи

Уча дизайн

Проучването е проведено в продължение на 7 дни и включва 25 доброволци, 16 жени и 9 мъже, на възраст 21-59 години. На 1 и 2 ден („нормална диета“) се водеха полупретеглени хранителни дневници и на 3 ден беше получена първа сутрешна празна проба от урина. На 3–6-ия ден („намалена интервенция с пшеница“) доброволците бяха помолени да ограничат приема на определен списък с хранителни продукти, които вероятно съдържат пшеница (хляб, сладкиши, тестени изделия, зърнени закуски и др.) И да ги заменят с елементи от списък от предложените алтернативи (напр. ориз, картофи). На 5-ия и 6-ия ден отново се водеха хранителни дневници и на ден 7 беше получена допълнителна първа сутрешна проба от урина и бе получено информирано съгласие от всички доброволци и етичното одобрение беше получено от Комитета по етика на NHS за изследване, Брадфорд, Великобритания.

Дневници за храна

Хранителните дневници са кодирани изцяло с помощта на вътрешен пакет за анализ на диетата, базиран на Microsoft Access, който използва UK Composition of Foods (Holland et al., 1992). За да се оцени спазването на интервенцията, честотата на консумация на определени групи храни (хляб, сладкиши, зърнени закуски и тестени изделия) по време на нормална диета (дни 1 и 2) е сравнена с тази по време на интервенцията (дни 5 и 6). Освен това се изчислява теглото на определени хранителни продукти и се определя приемът на храни на пшенична основа за всеки индивид въз основа на основните източници на пшеница (хляб, зърнени закуски, рула, тестени изделия, сладкиши и бисквити). Други източници на пшеница се срещат в храната, например в сосове и сгъстители. Въпреки това, техният принос в общия прием на пшеница се оценява от относително незначително значение.

Екстракция на DON в урината

Общият DON на урината беше измерен, като се използва модификация на метода на Meky et al. (2003) и използване на 13 C-DON (Biopure Referenzsubstanzen, Tulln, Австрия) като IS. IS беше смес, съдържаща предимно 13 C15-DON (молекулна маса (Мг) 311; 81,4%), но също така и 13 C14-DON (Мr 310; 16,8%). Пригодността на това съединение като IS в LC-MS/MS анализ на DON-замърсени зърнени култури беше наскоро установена (Haubl et al., 2006).

При нашия анализ на урина пробите се центрофугират (2000 ж; 15 минути; 4 ° C) и към 4 ml урина се добавя IS, за да се получи крайна концентрация от 5 ng/ml. РН на всяка проба се регулира на 6,8 и 23 000 U β-глюкуронидаза (тип IX-A от Ешерихия коли; Sigma) в 1 ml 75 mM KH2PO4 се добавя и се инкубира в разклащаща се водна баня в продължение на 18 часа при 37 ° С. След разграждането пробите се центрофугират (2000 г. ж; 15 минути; 4 ° С) и супернатантата се разрежда до 16 ml с PBS (рН 7.2). Разреденият материал се прекарва през DONtest ​​имуноафинитетни колони (IAC) (Vicam, Watertown, MA, USA), за да се извлече DON съгласно инструкциите на производителя. DON се елуира от колони с 4 ml метанол и екстрактите се сушат във вакуум с помощта на Savant Speed ​​Vac и възстановен през 250 μ1 от 10% (v/v) етанол за анализ. Две аликвотни части от проба от урина с известни нива на DON също бяха добавени с IS и анализирани с всяка партида от тестови проби като контрол на качеството (QC).

LC – MS анализ на извлечен DON

DON се анализира чрез HPLC (Waters 2795 модул за разделяне, Milford, MA, USA) с MS детекция (Micromass Quattro Micro троен квадруполен масспектрометър, Манчестър, Великобритания). Разделянето на DON беше постигнато с използване на колона Luna C18 (150 × 4.6 mm, 5 μm размер на частиците (Phenomonex, Macclesfield, UK). Подвижната фаза се инициира при 20% метанол и протича изохратично в продължение на 10 минути. След това се провежда фаза на промиване в продължение на 6 минути, като се използва 75% метанол, след което 20% метанол се въвежда отново с уравновесяване на системата при тази концентрация за още 11 минути. Скоростта на потока е 1 ml/min, а обемът на инжектиране е 25 μл. Една пета от елуента от HPLC колоната беше насочена в камерата за десолватиране на MS, а останалата част беше изпратена в отпадъци.

пшеницата

м/z Спектър на (а) немаркиран стандарт DON (200 ng/ml) и (b) IS (200 ng/ml) стандарт.

Обща йонна хроматограма на проба от урина, съдържаща 13,1 ng DON/ml урина, добавена с 13 C-DON вътрешен стандарт. Проследяване H + (a), генерирано от SIR на Na + DON наблюдаващи маси от 297,2 (DON) и 319,2 (DON); следа (b), генерирана от SIR от 13 C-DON мониторингови маси от 333,2 (13 C14-DON Na +) и 334,2 (13 C15-DON Na +). Времето на задържане на двете съединения е 7.4 минути.

Анализ на креатинин

Концентрациите на креатинин бяха измервани във всички проби от урина, използвайки клиничния метод на Bayer на инструмент ADVIA Chemistry Systems 1650 (отдел по клинична биохимия, Leeds General Infirmary, Leeds, UK). Крайната концентрация на DON в ng/ml урина се коригира, като се използват данните за креатинина и се изразява като ng DON/mg креатинин.

Статистически анализ

Когато DON в урината не може да се измери количествено, т.е. под LOQ, във всички анализи се използва средна стойност между LOQ и нула. Концентрациите на DON в урината са били естествено трансформирани в log преди анализ. Сравненията между сдвоените данни бяха направени с помощта на Student т-тест и беше приложен регресионен анализ за изследване на ефекта от възрастта, пола, антропометрията и приема на храна върху нивата на DON в урината както по време на нормалната консумация, така и по време на интервенцията за намаляване на пшеницата (използвайки STATA версия 7.0). Само по време на интервенционния период индивидите са разделени на потребители и непотребители на основен прием на храна на базата на пшеница и нивата на DON в урината в сравнение между групите, използвайки регресионен анализ в STATA. За улесняване на представянето, данните за пикочния ДОН бяха трансформирани обратно и бяха използвани геометрични средни стойности и 95% доверителен интервал (CI) в таблици.

Резултати

Данните за демографското проучване са представени в таблица 1. Имаше повече жени (н= 16) от мъжете (н= 9). Жените бяха и по-ниски (P Таблица 1 Демографски данни по пол.

По време на 1 и 2 ден от проучването хората консумират „нормалната“ си диета. Основните групи храни, за които се очаква да допринесат за експозицията на DON (някои зърнени закуски, хляб, бисквити, сладкиши и тестени изделия), се консумират в количества, съобразени с тези, съобщени по-рано за населението на Обединеното кралство (Henderson et al., 2002). Всички лица консумират поне една от тези групи храни всеки ден, а 18 от 25 (72%) консумират две или повече от тези групи всеки ден. Като цяло хлябът е най-честият източник на храна на основата на пшеница с консумация от 20 от 25 индивида на ден 1 и 22 от 25 на ден 2 (вж. Таблица 2). Торти и бисквити се консумират от 16 от 25 и 20 от 25 индивида, като зърнените храни и тестените изделия се консумират по-рядко (Таблица 2).

Интервенцията беше осъществена между дни 3 и 6 и беше записана информация в дневника, за да се оцени съответствието с предложената интервенция на дни 5 и 6. Като цяло се съобщава за добро спазване на инструкциите за намаляване на количеството консумирани храни на основата на пшеница. Намаляването на консумацията на храна на основата на пшеница, както по отношение на честотата на консумация, така и на общите консумирани количества, е подробно описано в Таблица 2. По време на интервенцията само един човек е консумирал хляб на ден 5 и два на ден 6. базирани зърнени закуски или тестени изделия, докато трима и шест души консумират торти и бисквити съответно на 5 и 6 ден. Намаляването на броя на лицата, консумиращи всяка от тези групи храни, е изключително значително, P Фигура 3

За 25 индивида бяха на разположение сдвоени проби за измерване на дезоксиниваленол в урината. Раираните ленти са за тези, които консумират нормалната си диета, а плътните черни ленти са за тези, които следват 4-те дни на интервенцията за намаляване на пшеницата. За шестнадесет индивида пробите, взети след интервенцията, са под границата на откриване.

Ограниченият брой индивиди и относително еднаквата консумация на основни потенциални източници на DON във фазата на нормалното хранене на проучването ограничават задълбочен анализ на приноса на специфични храни към нивата на DON в урината. В сравнение с периода на нормална диета, интервенционните нива на DON в урината са намалени за 24 от 25 индивида. Имаше само едно лице, което не се съобрази с предложената намеса. По време на фазата на нормалната диета този индивид консумира пълнозърнест хляб (средно 131 г/ден) като техен основен източник на пшеница. За този човек пълнозърнестият хляб остава основният източник на пшеница по време на интервенцията и на 5 и 6 ден приемът действително се увеличава (средно 154 g/ден). Това лице е единственото лице, за което нивото на ДОН в урината се е повишило от 5,2 ng/mg на 3-ия ден до 12,6 ng/mg на 7-ия ден. Като цяло средното тегло на храни на основата на пшеница, консумирани по време на нормалната диета (326 g; диапазон: 40–665 g и 299 g; диапазон: 0–523 g в дни 1 и 2, съответно) е значително по-нисък (P Таблица 3 Среден (95% CI) прием на пикочен ДОН и общ прием на храна на базата на пшеница по време на нормалната фаза на диета и интервенции за намаляване на пшеницата от проучването.

Дискусия

DON е често срещан замърсител на пшенични, ечемичени и царевични зърнени култури по целия свят, включително в Европа (Bondy and Pestka, 2000; SCOOP, 2003). Точните механизми, чрез които DON може да оказва неблагоприятно въздействие върху човешкото здраве, са неизвестни, но токсинът може да се свърже с рибозоми, нарушаващи синтеза на протеини, и освен това е в състояние да активира важни митоген-активирани протеинкинази, участващи в пътищата на трансдукция на сигнала (Pestka и Smolinski, 2005 ). Предполагат се гастроентерит, забавяне на растежа и имунотоксичност, с евентуално увеличаване на податливостта към инфекциозни заболявания, като най-вероятните ефекти върху приема на DON от човека (Pestka и Smolinski, 2005). Към днешна дата обаче липсата на валидиран биомаркер на експозицията затруднява нашето разбиране за последиците от експозицията на DON върху здравето.

Настоящото проучване е уникално при демонстриране на честото излагане на човек на DON в Обединеното кралство с помощта на пикочен биомаркер и при демонстриране, че експозицията може да бъде значително намалена чрез ограничаване на количеството пшеница в храната. За отбелязване е, че всеки индивид в проучването е имал откриваем пикочен ДОН, когато е консумирал нормалната си диета. DON замърсяването на ечемика и пшеницата, използвани за производството на бира, може да осигури допълнителен източник на експозиция (Papadopoulou-Bouraoui et al., 2004), въпреки че в нашето проучване бирата не е била част от намесата. Освен това бирата се консумира само шест пъти през 4-те дни на събиране на дневници (данните не са показани). Анализът включва измерване на общия DON в урината, т.е. свободния DON и DON, освободен от DON-глюкуронид след ензимно лечение. Аналитичният подход е едновременно чувствителен и специфичен с пречистване чрез високоселективна афинитетна колона на антитяло, последвано от хроматография с обратно фаза и последващо откриване от MS. Неотдавнашната наличност на 13 C-DON като IS допълнително подобри надеждността на този анализ.

Фармакокинетиката на екскрецията на DON и неговите метаболити с урината не е установена. Изглежда обаче, че глюкуронидът бързо се образува при свинете и има подобна кинетика на серумен клирънс като тази на изходното съединение (Goyarts and Danicke, 2006). Фармакокинетиката на клирънс на DON както при свине (Goyarts and Danicke, 2006), така и при плъхове (Meky et al., 2003) предполага, че 4 дни биха били достатъчни за отделяне на по-голямата част от DON, погълнат преди това, след като този микотоксин е бил елиминиран от диетата. Намаляването на нивата в урината след нашето 4-дневно интервенционно проучване е в съответствие с прогнозираното за други пикочни биомаркери за микотоксини, където маркерът обикновено отразява експозицията през предходните 24-48 часа поради бързото отделяне (Groopman et al., 1992).

Неотдавнашното проучване SCOOP (2003) в Европейския съюз подчерта замърсяването на зърнените култури и зърнените продукти от DON и предложи в някои случаи в Обединеното кралство TDI да бъде надвишено. Съществуват обаче много несигурности при установяването на излагането на човек на DON чрез анализ на храните и оценки на приема на зърнени храни. Първо и най-важно е известната хетерогенност на замърсяването с микотоксини на дадена хранителна стока, което затруднява постигането на представителни проби от храни за анализ. Второ, експозицията зависи не само от замърсяването, но и от нивото на консумация. Това може да се определи от диетични проучвания, но може да не отчете адекватно крайностите на приема на индивидуално ниво или в конкретни подгрупи в популацията, например вегетарианци и кърмачета. Разработването на пикочен ДОН биомаркер обещава по-обективна мярка за експозиция на индивидуално ниво. Този подход е постигнат успешно с афлатоксини и е довел до значителен напредък в разбирането на експозицията и свързаните с това ефекти върху здравето (Wild and Turner, 2002).

Използвайки концентрацията на DON в урината в ng/ml урина за всеки индивид и телесното тегло (телесно тегло) на всеки индивид, беше възможно да се получи груба оценка на приема. Тази оценка се основава на проучвания, получени от модел на плъх (Meky et al., 2003) и предполага (а) концентрацията на DON в пробата от сутрешната урина е представителна за целия ден; (б) отделяне на 1,5 л урина на ден (Curhan et al., 2001; Van Haarst et al., 2004); (c) ∼ 35% от приетия DON се екскретира с урината; и (г) че всички ДОН на пикочните пътища произхождат само от предходните 24 часа прием. Съответно, за индивидите, консумиращи нормалната си диета, наблюдаваните нива в урината (средно 10,7 ng DON/ml: диапазон: 2,4–67,8 ng/ml) тук се превръщат в среден прием от 729 ng/kg (телесно тегло)/ден, ниво, което е от същия порядък, макар и от високата страна, както се оценява в доклада на SCOOP за 2003 г. за възрастни във Великобритания. Следователно в нашето малко проучване сред 25 индивида, 4 ще се предвиди да надвишат препоръчителния TDI от 1000 ng/kg (телесно тегло)/ден (SCF, 2002). Въпреки това, предупрежденията в тази оценка, по-специално предполагаемият% от DON, екскретиран в урината при хора, означават, че данните трябва да се тълкуват с повишено внимание. Ако например 50% от погълнатия ДОН са били екскретирани, както се наблюдава при свинете (Goyarts and Danicke, 2006), тогава очакваните количества биха били малко по-ниски.

Като се има предвид очевидната обща експозиция и мощната токсичност, проявена от DON при животни (Pestka и Smolinski, 2005), е важно да се изследват потенциалните ефекти върху здравето на настоящите нива на експозиция при хората. Бебетата и децата се предвиждат да имат по-високи нива на прием в сравнение с възрастните и както при повечето токсични експозиции, много младите могат да бъдат особено податливи. Други високорискови групи могат да включват вегетарианци, които консумират особено високи нива на зърнени храни. Наличието на биомаркер на експозиция прави подобни проучвания реалистични за първи път.