Резюме

Резюме

При муковисцидоза (CF) дефектната функция на трансмембранния регулатор на проводимостта на муковисцидозата (CFTR) в епителните клетки на дихателните пътища и субмукозните жлези води до хронично заболяване на дихателните пътища, проявяващо се с обструкция на дихателните пътища и повтарящи се инфекции на белите дробове и параназалните синуси (1 ), който започва в началото на живота (2). CF белият дроб е особено податлив на Pseudomonas aeruginosa, и този организъм играе критична роля в развитието и прогресирането на белодробна болест при CF (1). Хората с МВ получават ендобронхиална инфекция, която предизвиква интензивен възпалителен отговор, който изглежда прекомерен (3). Животински модели на ендобронхиална инфекция с Pseudomonas aeruginosa имат хистопатологични характеристики, подобни на тези, присъстващи в белите дробове на пациенти с МВ (4, 5), и са били използвани за изследване на белодробно възпаление, характерно за това заболяване (6-8).

върху

В допълнение, няколко изследователи отбелязват, че животните са инокулирани с Псевдомонада-натоварените агарозни мъниста са загубили значително повече тегло, отколкото контролните животни, третирани със стерилни мъниста (6, 7). Механизмът на отслабване при този животински модел обаче е несигурен. Неуспехът в растежа остава важен проблем при МВ, а хроничното недохранване също е свързано с прогресията на белодробните заболявания (9, 10). Факторите, свързани с белодробни обостряния, като инфекция, възпаление и повишена работа на дишането, могат да доведат до увеличен разход на енергия и намален прием на калории. Всъщност се предполага, че такива обостряния водят до допълнително влошаване на хранителния статус и белодробната функция при пациенти с МВ (11, 12). Тъй като същите фактори, които причиняват кахексия при тези животни, могат да допринесат и за загубата на тегло, наблюдавана по време на белодробни обостряния при пациенти с МВ, ние оценихме връзката между инфекция, възпаление и променена белодробна резистентност при загуба на тегло, наблюдавана по време на бронхопулмонална инфекция с Псевдомонада при мишки.

Мъжки мишки C57BL/6 (на възраст от 6 до 8 седмици), закупени от Charles River Laboratories (Bar Harbor, ME), бяха хранени с автоклав Purina Mouse Chow 5010 и стерилна вода беше достъпна през цялото време. Всички мишки се поддържат в статични микроизолаторни единици.

Моделът от агарозни топчета на хроничен Псевдомонада ендобронхиалната инфекция е разработена от Cash и колеги (4) и модифицирана за мишки от Starke и колеги (5). Този модел е използван за създаване на хронична белодробна инфекция при мишки с няколко вариации. Накратко, агарозата се смесва с триптичен соев бульон (TSB) за стерилни мъниста или TSB, съдържащ мукоид P. aeruginosa щам M57-15, клиничен изолат от пациент с МВ, отгледан до късна фаза на лога. Сместа от агароза-бульон се добавя към минерално масло, което се уравновесява при 50 ° С, бързо се разбърква в продължение на 6 минути при стайна температура, след което се охлажда в продължение на 10 минути. Агарозните зърна се измиват веднъж с 0,5% дезоксихолова киселина, натриева сол (SDC) в буфериран с фосфат физиологичен разтвор при pH 7,4 (PBS), веднъж с 0,25% SDC в PBS и четири пъти с PBS. Зърната са измерени с диаметър от 93 до 166 μm чрез светлинна микроскопия. Количествена бактериология беше извършена върху аликвотна част от хомогенизирана суспензия от зърна, за да се определи броят на образуващи колонии единици (CFU) на милилитър (приблизително 1.3 × 10 7 CFU/ml суспензия). Стерилните препарати от мъниста бяха потвърдени като стерилни.

Бяха проведени общо осем експеримента за оценка на загуба на тегло, бактериология и възпалителни параметри. Резултатите от тези експерименти са комбинирани. Не всички измервателни резултати са еднакви за всеки експеримент. Убити са общо 18 нелекувани мишки. Седемдесет и седем мишки бяха инокулирани със стерилни мъниста, от които три умряха от следоперативни усложнения. Деветдесет и шест мишки бяха инокулирани с Псевдомонада-натоварени мъниста от агароза. Шест от тях са починали от следоперативни усложнения, седем са били неправилно заразени поради технически затруднения, двама са били убити 4 дни след инфекцията поради продължителна загуба на тегло и лоши клинични признаци, а трима са били намерени мъртви 6 до 7 дни след инфекцията в резултат на масивна белодробно засягане.

Имаше 12 нелекувани мишки, тествани за белодробна механика, 10 от които оцеляха в процедурата. От 33 мишки, които бяха успешно инокулирани със стерилни мъниста, 26 бяха успешно тествани, а от 38 мишки, които бяха успешно инокулирани с P. aeruginosa-натоварени агарозни мъниста, 33 завършиха теста задоволително. Мишките, които не са оцелели от процедурата за тестване, умират или поради проблеми с анестезията, или поради невъзможност да канюлират трахеята, причинени от технически затруднения. Тези мишки не бяха включени в анализа.

След BAL белите дробове бяха фиксирани с инфлация в 2% параформалдехид в PBS в продължение на най-малко 48 часа, след това веднъж срезани средно сагитално и вградени в парафин. Тканевите срезове бяха разрязани по целия тъканен блок, така че 5-μm участъци бяха взети на равни интервали, които обхващаха пълния краниокаудален диапазон на секциите. Разрезите бяха оцветени с хематоксилин-еозин, използвайки стандартни техники и изследвани за хистопатологични промени.

Белите дробове на мишки, инокулирани с агарозни мъниста, вградени с P. aeruginosa се изрязват асептично и се хомогенизират в 40 ml нормален физиологичен разтвор при рН 7,4 и проби от белодробни и BAL хомогенати се култивират количествено чрез серийно разреждане върху плочи с агар на MacConkey. Далаците бяха отстранени и хомогенизирани в 1.0 ml стерилен PBS. 10-μl аликвотна част от далачния хомогенат се прилага върху плочи от триптичен соев агар (TSA). Кръвта също беше събрана и набраздена върху TSA плочи. Белите дробове на мишки, инокулирани със стерилни мъниста, се изрязват асептично, хомогенизират се в 20 ml стерилен PBS при рН 7.4 и се поставят върху TSA плаки в два екземпляра. Плаките се инкубират при 37 ° С и се проверяват за P. aeruginosa колонии след поне 24 часа.

Фиг. 1. Промяна в проценти от първоначалното телесно тегло. C57BL/6 мишки бяха инокулирани само с анестезия (затворени диаманти) (n = 6 до 7), стерилни агарозни мъниста (затворени кръгове) (n = 11 до 34) или P. aeruginosa-натоварени агарозни мъниста (затворени триъгълници) (n = 7 до 34) и се претегля. Мишките отслабнаха след интратрахеална инокулация с Псевдомонада-натоварени агарозни мъниста, които достигнаха своя връх 3 дни след инокулацията (-13,7 ± 1,3%). Мишките, третирани със стерилни мъниста, също отслабват 3 дни след инокулацията (-4,6 ± 0,7%). Контролните мишки, лекувани само с анестезия, отслабват 1 ден след инжектирането (-1,5 ± 0,5%), но след това наддават. За определяне на значимостта е използван еднопосочен ANOVA върху ранговете (p ‡ Значително различен от мишките, третирани със стерилни агарозни мъниста.

Броят на белодробните бактерии беше максимум 3 дни след мишките бяха инокулирани с P. aeruginosa (Фигура 2) и намалява на 4 d, но Псевдомонада все още е изолиран 7 дни след инокулация с заразени мъниста. Само три мишки, третирани със стерилни мъниста, са имали една бактериална колония върху културата; останалите бяха отрицателни за културата. BAL от седем нелекувани животни са с отрицателна култура. Нито една мишка не е имала положителни кръвни култури P. aeruginosa (п = 11). Само една мишка има хомогенат на далак, който е положителен за Псевдомонада 3 d след инокулация с заразени мъниста.

Фиг. 5. Хистопатология на белия дроб на мишката след интратрахеална инокулация с Псевдомонада-натоварени мъниста. Микрофотографиите показват представителни белодробни срези от мишки C57BL/6, които са били инокулирани със стерилни (A и Б.) или P. aeruginosa-натоварен (° С и д) мъниста от агароза и убити 3 (A и ° С ) или 10 дни (Б. и д) по късно. Белите дробове бяха взети от мишки и оценени за доказателства за хистопатология чрез микроскопско изследване на участъци, оцветени с хематоксилин-еозин. Стерилни мъниста (затворени стрелки) са били свързани с лек, локален мононуклеарен инфилтрат в дихателните пътища, докато P. aeruginosa-натоварени мъниста (отворени стрелки) предизвика по-широко перибронхиално и ендобронхиално възпаление, както и неутрофилна инфилтрация в съседния паренхим.

Нямаше разлика в общата белодробна резистентност между нетретираните мишки (1,23 ± 0,06 cm H2O/ml/s) или мишките, инокулирани със стерилни или P. aeruginosa-натоварени агарозни зърна 2 дни след третирането (1,13 ± 0,08 cm H2O/ml/s и съответно 2,95 ± 1,32 cm H2O/ml/s) или по всяка друга изследвана точка от време. Ефектът от интравенозното приложение на карбахол върху белодробната реактивност 2, 7, 14 или 21 d е илюстриран на Фигури 6 A, 6B, 6C и 6D, съответно, след инокулация на животни със стерилни (n = 12, 4, 8, 3, съответно) или Псевдомонада-натоварени (п = 10, 10, 8, 6, съответно) агарозни мъниста. Няма значителни разлики в R1 или Cdyn между мишки, лекувани с Псевдомонада-натоварени агарозни мъниста и мишки, третирани със стерилни агарозни мъниста във всеки от изследваните моменти от време. Най-високата концентрация на прилаган карбахол (1 μg/g телесно тегло) предизвиква умерено увеличение на R1 и намаляване на Cdyn при нетретирани мишки и няма разлика между нетретирани мишки и мишки, инокулирани със стерилни агарозни мъниста (данните не са показани).

Фиг. 6. Белодробна хиперреактивност към карбахол. Ефектите от интравенозното приложение на карбахол върху белодробната резистентност бяха оценени след инокулация на мишки (A) 2 d, (Б.) 7 дни, (° С ) 14 d, или (д) 21 d след инокулация със стерилни (затворени кръгове) (n = 12, 4, 8, 3, съответно) или Псевдомонада-натоварен (затворени триъгълници) (п = 10, 10, 8, 6, съответно) агарозни мъниста. Няма разлики в отговора на карбахол в P. aeruginosa-заразени мишки в сравнение с мишки, третирани със стерилни мъниста. Няма разлика между нелекувани мишки и мишки, които са получили стерилни мъниста (данните не са показани).

Извършен е линеен регресионен анализ (таблица 1), сравняващ промяната в телесното тегло с концентрацията на възпалителни медиатори и абсолютния брой на неутрофилите в BAL течност на мишки 3 d след инокулация P. aeruginosa-натоварени мъниста. Загуба на тегло, пряко корелирана с нивата на mTNF-α (R = -0.678), mIL-1β (R = -0.774), mip-2 (R = -0.902), KC (R = -0.835) и абсолютен брой на неутрофилите (R = −0,752) в BAL. Имаше и пряка връзка между абсолютния брой на неутрофилите и концентрациите на mIL-1β (R = 0.825), mip-2 (R = 0.781) и KC (R = 0.779) в BAL течността. Няма връзка обаче между концентрацията на цитокини в BAL течност и отговора на белите дробове до 0,75 mg/kg карбахол, прилаган интравенозно (p

Таблица 1. АНАЛИЗ НА ЛИНЕЙНАТА РЕГРЕСИЯ НА ОТСЛАБВАНЕТО, АБСОЛЮТНИЯ НЕУТРОФИЛЕН НОМЕР И ПРОФИЛАМАТОРНИТЕ МЕДИАТОРИ, ИЗПОЛЗВАЩИ СТОЙНОСТТА НА СЪОТВЕТСТВИЕТО НА МОМЕНТА НА ПРОДУКТА НА PEARSON

Определение на съкращенията: mTNF-α = фактор на некроза на миши тумор-алфа; mIL-1β = миши интерлевкин-1бета; mIL-6 = миши интерлевкин-6; mip-2 = макрофаги възпалителен протеин-2; KC = KC/N51.

* Мишките бяха инокулирани с Псевдомонада-натоварени мъниста от агароза и убити 3 дни по-късно. Налице е положителна корелация между процентната промяна в първоначалното телесно тегло и провъзпалителните медиатори mTNF-α, mIL-1β, mip-2 и KC в бронхоалвеоларна течност за промивка. Имаше и пряка връзка между абсолютния брой на неутрофилите и концентрациите на BAL на mIL-1β, mip-2 и KC.

† Показва значителна корелация, стр

Таблица 2. ВЪЗПАЛИТЕЛНИ МЕДИАТОРИ И СЪОТВЕТСТВИЕ С УСТОЙЧИВОСТ НА БЕЗБЕГ

За дефиниция на съкращения, вижте маса 1.

* Белодробната резистентност е измерена при осем мишки 2 d след инокулация с P. aeruginosa-натоварени мъниста от агароза. След това мишките бяха убити и BAL течността беше събрана, както е описано. Няма връзка между нивата на провоспалителни медиатори в BAL течност и белодробна резистентност, независимо от дозата на карбахол. Стойностите са показани като средни стойности ± SEM.

Фиг. 7. Мишки, хранени по двойки. (A) Храна и (Б.) консумация на вода за мишки, инокулирани със стерилни (затворени кръгове) или заразени (затворени триъгълници) мъниста се изчислява като количеството храна (g) или вода (ml), което се консумира за 24-часов период на клетка, разделено на броя на мишките и след това се определя процентното първоначално потребление. И двете кохорти от мишки ядат и пият по-малко първия ден след инокулацията и след това ядат нормално след това. Въпреки това, заразените мишки продължават да пият по-малко вода от нормалните мишки. (° С ) Заразените мишки са загубили значително повече тегло от контролните мишки, хранени с двойка (отворени триъгълници). * Значимостта е оценена с помощта на теста за ранг на Ман-Уитни (стр

Таблица 3. АНАЛИЗ НА СЪСТАВА НА ТЯЛОТО *

* Мишките бяха инокулирани със стерилни (n = 8) или P. aeruginosa-натоварени (n = 7) мъниста. Контролните мишки бяха нелекувани (n = 8) или хранени по двойки. Двойно хранените мишки са хранени със същото количество храна за период от 24 часа, който заразените мишки са яли през предходните 24 часа. Три дни след лечението, мишки бяха убити. Мокрото тегло се определя чрез претегляне на кланичните трупове и сухото тегло се измерва, след като труповете се дехидратират. Теглото на водата се изчислява като разлика между мокро и сухо тегло (g). Процентното тегло на сухото и водното тегло е спрямо мокрото тегло на трупа. Мускулната маса се определя от изсушените тежести на мускулите на краката на гастрокнемия и сарториуса. Относителната мускулна маса се изразява като мускулна маса спрямо сухото тегло на трупа (грамове мускулна маса/грама сухо тегло). Заразените мишки имат по-малко мокро тегло, по-голям процент водно тегло и по-малко мускулна маса в сравнение с контролните животни. Стойностите са средни стойности ± SEM.

† p = 0,024 спрямо нелекувани мишки.

‡ p ⩽ 0,007 в сравнение с мишки, инокулирани с P. aeruginosa-натоварени мъниста.

§ p ⩽ 0,05 спрямо мишки, третирани със стерилни мъниста.

‖ P = 0,013 в сравнение с двойно хранени мишки.

¶ p ⩽ 0,027 спрямо стерилни мишки, третирани с мъниста.

** p ⩽ 0,002 в сравнение с нетретирани мишки.

F3-164 p = 0,027 спрямо мишки, хранени с двойка.

Пациентите с МВ, в разгара на остро белодробно обостряне, често имат значителна загуба на тегло. Няколко изследователи са показали, че загубата на тегло по време на остри белодробни обостряния е резултат от по-голям разход на енергия в покой (11, 12, 14), но все още не е ясно дали тази промяна в разхода на енергия в покой е причинена от променена белодробна функция, ненормален състав на тялото поради малабсорбция на мазнини, хронична или остра инфекция или възпаление, свързано с наличието на провъзпалителни медиатори в белия дроб. В експерименти, използващи животински модел на хронична бронхопулмонална инфекция, който много прилича на белодробната патология, наблюдавана при пациенти с CF, мишки, заразени с мукоидни P. aeruginosa са имали значителна загуба на тегло 3 дни след инокулацията в сравнение с контролните животни (7). В това проучване промяната в телесното тегло корелира с BAL концентрациите на mTNF, mIL-1β, mip-2 и KC и абсолютния брой на неутрофилите 3 d след инокулация с P. aeruginosa-натоварени мъниста от агароза. Освен това загубата на тегло директно корелира със степента на белодробно възпаление, а не с промени в белодробната функция.

В това проучване мишките C57BL/6 бързо развиват белодробно възпаление в отговор на P. aeruginosa. Тази интензивна възпалителна реакция, измерена чрез концентрации на цитокини и абсолютни числа на неутрофили в течността на бронхоалвеоларния лаваж (BAL), е преходна и достига близо до изходните нива със 7 до 10 дни след инокулацията. Няма мишки, тествани 3 дни след Псевдомонада инокулацията е имала клинични доказателства за септицемия, въпреки че е даден далак хомогенат от една мишка P. aeruginosa. Възпалението все още е налице при мишки 10 дни след инфекцията, както се посочва от наличието на белодробна хистопатология и променен диференциал на левкоцитите в BAL течност. Концентрацията на неутрофилния хемокин, mip-2, в BAL течност отразява броя на неутрофилите в BAL течността. И числото на неутрофилите, и концентрацията на mip-2 достигнаха връх 3 дни след заразяване с Псевдомонада. Абсолютният брой на неутрофилите и концентрацията на mip-2 в BAL течност са положително корелирани (R = 0,791, p Khan T. Z., Wagener J. S., Bost T., Martinez J., Accurso F. J., Riches D. W. Ранно белодробно възпаление при бебета с муковисцидоза. Am. J. Respir. Крит. Care Med.151 1995 1075 1082