Zhiqiang Wang

1 Катедра по превантивна медицина и здравен мениджмънт, Университет Хъбей, Баодин 071002, Китай; moc.liamg@43210qzgnaw

срещу

2 Департамент по хранителни науки и хранене, Hallym University, Chuncheon 24252, Корея; moc.liamg@hshosi

Seung Hwan Hwang

2 Департамент по хранителни науки и хранене, Hallym University, Chuncheon 24252, Корея; moc.liamg@hshosi

Джу Хи Ким

3 Институт по естествена медицина, Hallym University, Chuncheon 24252, Корея; ten.liamnah@kjhhjk6023

Скоро Сунг Лим

2 Департамент по хранителни науки и хранене, Hallym University, Chuncheon 24252, Корея; moc.liamg@hshosi

3 Институт по естествена медицина, Hallym University, Chuncheon 24252, Корея; ten.liamnah@kjhhjk6023

4 Институт по корейско хранене, Hallym University, Chuncheon 24252, Корея

Резюме

1. Въведение

За да се определи дали затлъстяването при мишки може да бъде подобрено чрез добавяне на диета с VD, в това проучване анти-адипогенните ефекти на екстрактите от горната част на растението (стъблото и листата) и корена на VD бяха първо изследвани и сравнени в 3T3- L1 адипоцити; освен това изследвахме ефектите от затлъстяването на екстракта от горната част на VD, известен като ядливата част на растението, при мишки със затлъстяване, предизвикани от диета с високо съдържание на мазнини.

2. Материали и методи

2.1. Растителни материали и приготвяне на екстракта

Цялото растение на VD е събрано от остров Ulleung през май 2015 г. Изсушените надземни (стъбло и листа) и подземни (коренови) части на VD (1,5 kg) се пулверизират и след това се екстрахират с помощта на 70% етанол ( 15 L) при стайна температура за 48 h. Екстрактите на VD от надземен (VDAE) и подземен (VDBE) бяха филтрирани с помощта на филтърна хартия (Hyundai Micro No. 20, Бучон, Корея) и концентрирани чрез изпарител с намалено налягане (N-1000, Tokyo Rikakikai, Tokyo, Япония) и след това накрая лиофилизирани с помощта на PVTFD10R (Ilshinbiobase Co., Ltd., Yangju, Корея) за получаване на екстракт на прах.

2.2. 3T3-L1 Клетъчна култура и лечение

3D3-L1 миши преадипоцити са получени от American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) и са култивирани до сливане при 37 ° C под овлажнена 5% CO2 атмосфера в Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Waltham, MA, САЩ), включително 10% говежди телешки серум (GenDEPOT, Katy, Тексас, САЩ) и 100 U/mL пеницилин-стрептомицин (Gibco). Два дни след като клетките достигнат сливане (ден 0), преадипоцитите на 3T3-L1 се култивират в диференцираща среда (DM), съдържаща 10% фетален говежди серум (FBS, Gibco), 10 μg/mL инсулин (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури, САЩ), 0,5 mM 3-изобутил-1-метиксантин (IBMX, Sigma-Aldrich) и 1 μM дексаметазон (Sigma-Aldrich). Два дни след стимулация с индуктор на диференциация (MDI, включително 0,5 mM IBMX, 1 μM дексаметазон и 10 μg/ml инсулин) (ден 2), средата се превръща в 10% FBS/DMEM среда, съдържаща 10 μg/ml инсулин. След два дни (ден 4) средата беше сменена на 10% FBS/DMEM среда и култивирана в 10% FBS/DMEM среда на всеки два дни. Пълна диференциация беше постигната до ден 8. По време на диференциацията, екстрактите от VD бяха третирани, за да инхибират диференциацията на адипоцитите върху култура 3T3-L1 при концентрации от 10 и 50 μg/ml между дни 0 и 4.

2.3. Маслено червено оцветяване и определяне на липидното съдържание

За да се изследва както адипогенен потенциал, така и натрупване на липиди, клетките се оцветяват с разтвор на Oil Red O (Sigma-Aldrich). На 8-мия ден култивираните 3T3-L1 клетки се промиват със студен фосфатно-буфериран физиологичен разтвор (PBS) и след това се фиксират с 10% формалдехид при стайна температура. Клетките се оцветяват с филтриран 0,5 μg/ml разтвор на Oil Red O (0,5 g Oil Red O в 500 ml изопропилов алкохол) и се промиват два пъти. Липидните капчици се разтварят в изопропанол и абсорбцията се измерва при 540 nm с помощта на четец на микроплаки (Sensident Scan, Labsystems, Хелзинки, Финландия).

2.4. Анализ на клетъчната жизнеспособност

Клетъчната жизнеспособност на екстракти от VD в 3T3-L1 клетки беше изследвана с помощта на 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4-сулфофенил) -2Н-тетразолий, вътрешен комплект за анализ на сол (MTS) (Promega, Madison, WI, USA) съгласно инструкциите на производителя. 3T3-L1 клетки (5 × 10 3/ямка) се култивират в 96-ямкови плаки и се обработват с екстракти от VD (10 и 50 μg/ml). Оптичната плътност при 490 nm е измерена три пъти с помощта на четец на микроплаки (Sensident Scan).

2.5. Изследване на животните и техния хранителен режим

маса 1

Състави от експериментални диети (g/kg).

Групи 1 NFDHFDGRDVDD
Казеин210265265265
L-цистин3444
Царевично нишесте280---
Малтодекстрин50160150150
Захароза325909090
Свинска мас20.310310310
Соево масло20.303030
Целулоза37.1565.565.565.5
Минерална смес 2 35484848
Витаминна смес 3 1521.21.21.
Калциев фосфат, диабазик23.43.43.4
Холин битартрат2.75333
Жълт хранителен цвят0,1---
Син хранителен цвят-0,10,10,1
Екстракт от гарциния камбоджа от 60% (-) - хидроксилимонена киселина--10-
Valeriana dageletiana Nakai ex F. Maek екстракт от надземна част---10
Общо (g)1000100010001000

1 NFD; нормален контрол на мастната диета, HFD; контрол на диетата с високо съдържание на мазнини, GRD; HFD + 1% екстракт от гарциния камбоджа, VDD; HFD + 1% Valeriana dageletiana Nakai ex F. Maek екстракт от надземна част. 2 Минералната смес е съгласно AIN-93G-MX (94046). 3 Витаминната смес е съгласно AIN-93-VX (94047).

2.6. Колекция от проби от серум и тъкани

След 10 седмици всички мишки бяха умъртвени след 12-часово гладуване и тъканите бяха събрани за анализ. Кръв се събира от долната куха вена и се отделя незабавно чрез центрофугиране при 3000 об/мин при 4 ° С за 15 минути, за да се изолира серумът. Епидидималната мастна тъкан и черният дроб се отстраняват, претеглят и съхраняват при 80 ° C до анализ.

2.7. Биохимичен анализ

Нива на триацилглицерол (TG), липопротеин с висока плътност (HDL) холестерол, липопротеин с ниска плътност (LDL) холестерол, серумна аланин аминотрансфераза (ALT), аспартат аминотрансфераза (AST), азот на уреята в кръвта (BUN) и креатинин (CREA) в серум са измерени с търговски комплекти (981786, 981823, 981656, 981769, 981771, 981820 и 981811, съответно, Thermo Electron Corporation, Vantaa, Финландия) и анализатор Thermo Fisher Konelab 20XTi (Thermo Electron Corporation, SeoKwang LABOTECH, Сеул, Корея).

2.8. Хистологичен анализ

Епидидималните мастни тъкани бяха фиксирани с 4% формалдехид и вградени в парафин. Изрязват се срезове (с дебелина 5 μm) и всяка секция се оцветява с хематоксилин и еозин (Н и Е). Всички срезове бяха заснети с помощта на оптичен микроскоп (Leica RM2235, Wetzlar, Германия) и отпечатани при крайно увеличение от 200 ×. Изображенията са наблюдавани с микроскоп (Axiomager, Zeiss, Германия) и диаметърът на всеки адипоцит е анализиран с помощта на AxioVisionRel. 4.8 софтуер (Carl Zeiss, Oberkochen, Германия).

2.9. Екстракция на РНК, синтез на cDNA и PCR в реално време

Общата РНК беше извлечена от епидидималната мастна тъкан, използвайки комплект Easy-Blue (Intron Biotechnology Inc., Сеул, Корея), съгласно протокола, предоставен от производителя. След това, общата РНК беше количествено определена с NanoDrop-2000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA). cDNA е синтезирана (0,03 μg от общата РНК) с Mononey миши левкемичен вирус транскриптаза и Oligo (dT) 15 праймери (Promega, Medison, WI, USA) с помощта на Life Touch термоциклер (Life Eco, Bioer Technology, Хангжу, Китай) . Програмата беше настроена за 1 h иницииране при 42 ° С, последвана от 10 минути инкубация при 95 ° С и 10 минути при 4 ° С. RT-PCR се извършва с помощта на QuantiTect SYBR Green PCR комплект (Qiagen), съгласно инструкциите на производителя. CDNA (20 μL) се усилва за 40 цикъла на денатурация (95 ° C за 30 s), отгряване (57 ° C за 40 s) и удължаване (72 ° C за 40 s) с помощта на PCR в реално време на RotorGene RG3000 машина (Corbett Research, Сидни, Австралия). Чистотата на PCR продуктите се определя с помощта на анализ на кривата на топене. Относителното количествено определяне на експресията на всеки ген беше изчислено, използвайки метода на сравнителния прагов цикъл (Ct) (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). нивата на тРНК се нормализират до β-актин. Последователностите на грундовете са показани в Таблица 2 .

Таблица 2

Последователност на праймерите, използвани в PCR в реално време.

Последователност на GenePrimer (5 ’→ 3’)Forward Primer Reverse Primer
β-актинGTCGTACCACTGGCATTGTGGCCATCTCCTGCTCAAAGTC
C/EBP-αAGACATCAAGCGCCTACATCGTGTAGGTGCATGGTGGTCTG
PPAR-γCCCTGGCAAACGATTTGTATAATCCTTGGCCCTCTGAGAT
SREBP-1cGCGCTACCGGTCTTCTATCATGCTGCCAAAAGACAAGGG
CD36TCCTCTGACATTTGCAGGTCTATCGTGAATCCAGTTATGGGTTCCAC
SCD-1CGAGGGTTGGTTGTTGATCTGTATAGCACTGTTGGCCCTGGA
FASGATCCTGGAACGAGAACACAGACTGTGGAACACGGTGGT
aP2AACACCGAGATTTCCTTCAATCACGCCTTTCATAACACAT

2.10. NMR-базирана чернодробна метаболомика

Базираната на ЯМР чернодробна метаболомика, включваща подготовка на чернодробна тъкан, придобиване на пулс и идентификация на метаболит и обработка на данни, са извършени съгласно предишни доклади с незначителни модификации [20,21]. Липофилните екстракти, които съдържат липидните съставки на черния дроб, се използват за 1 HNMR спектроскопия. Чернодробната тъкан (0,1 g) първо се хомогенизира в 1 ml хлороформ/метанол (CHCI3/MeOH, 3: 1, v/v). След това, след центрофугиране при 10 000 об/мин в продължение на 10 минути при 4 ° С, супернатантата се събира и се суши под поток от азот. Липофилните екстракти се разтварят с 665 μL деутериран хлороформ/метанол (CDCI3/CD3OD, 3: 1, v/v), включително тетраметилсилан (TMS) като вътрешен стандарт в NMR анализ. 1Н NMR спектрите на изолираните чисти съединения бяха записани с помощта на инструмент Bruker AV 400.

2.11. Статистически анализ

Данните от отделни експерименти се изразяват като средна стойност ± SE и сравненията на данните се извършват с помощта на сдвоен t-тест на Student или еднопосочен ANOVA, според случая. p Фигура 1 А, VDAE не е имал значителни ефекти върху жизнеспособността след 24 часа лечение; обаче, VDBE намалява жизнеспособността на клетките с около 10%, което показва, че VDBE би бил цитотоксичен за 3T3-L1 клетки.