Роли Формален анализ, разследване, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

модел

Фармакологичен отдел, Медицина Weill Cornell, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

Роли Формален анализ, разследване, писане - преглед и редактиране

Агенция по фармакология, Weill Cornell Medicine, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

Роли Формален анализ, разследване, писане - преглед и редактиране

Фармакологичен отдел, Weill Cornell Medicine, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати, Училище за градско обществено здраве, Хънтър Колидж, Университет на Ню Йорк, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени щати

Роли Формален анализ

Фармакологичен отдел, Медицина Weill Cornell, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

Роли Формален анализ, писане - преглед и редактиране

Агенция по фармакология, Weill Cornell Medicine, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

Роли Формален анализ

Партньорски отдел по патология, Weill Cornell Medicine, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

Роли Концептуализация, разследване, администриране на проекти, надзор, писане - преглед и редактиране

Фармакологичен отдел, Медицина Weill Cornell, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати, Висше училище по биомедицински науки Weill Cornell, Ню Йорк, Ню Йорк, Съединени американски щати

  • Марта Мелис,
  • Сяо-Хан Танг,
  • Стивън Е. Тразино,
  • Вирусен М. Пател,
  • Даниел Дж. Щъмър,
  • Хосе Джесурун,
  • Лотарингия J. Gudas

Фигури

Резюме

Цитат: Melis M, Tang X-H, Trasino SE, Patel VM, Stummer DJ, Jessurun J, et al. (2019) Ефекти на AM80 в сравнение с AC261066 в модел на диета с високо съдържание на мазнини при чернодробно заболяване. PLoS ONE 14 (1): e0211071. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211071

Редактор: Michael Schubert, Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-Mer, ФРАНЦИЯ

Получено: 1 октомври 2018 г .; Прието: 7 януари 2019 г .; Публикувано: 24 януари 2019 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни се намират в ръкописа и в неговите поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Това изследване беше подкрепено от фондове на Weill Cornell и от NIH R01 CA043796 и R01 DK113088 към LJG. SET беше подкрепен от NCI T32 CA062948 за част от това изследване. MM беше подкрепен от NCI T32 CA062948 за част от това изследване.

Конкуриращи се интереси: Weill Cornell Medicine (WCM) е подал патенти за част от интелектуалната собственост в този ръкопис и те са били лицензирани на Sveikatal, Inc. LJG и XHT са основатели и имат финансови интереси в Sveikatal, Inc. SET е изобретател на интелектуалната собственост ( IP), собственост на WCM. MM, VMP, DJS и JJ не съобщават за конфликти на интереси, свързани с тази публикация. Това не променя придържането ни към политиките PLOS ONE за споделяне на данни и материали. • US20180263924A1 "Методи за лечение на състояния, свързани с метаболитен синдром, използващи агонисти на рецептора на ретиноева киселина" • US10010512B2 "Методи за лечение на заболявания, свързани с диета с високо съдържание на мазнини и дефицит на витамин А, използващи агонисти на рецептора на ретиноева киселина".

Въведение

Наскоро демонстрирахме, че прилагането на високоселективен RARβ2 агонист, AC261066 [20], намалява хипергликемията и чернодробната стеатоза при няколко миши модели на диабет тип 2 (T2D) и NAFLD [16, 17]. Тук сравнихме този селективен агонист за RARβ2, AC261066, със селективен агонист за RARα, AM80 [21-23], в миши модел на NAFLD, индуциран с високо съдържание на мазнини (HFD). Открихме, че AC261066 и AM80 показват противоположни ефекти и че AM80 засилва HFD-индуцирания NAFLD.

Материали и методи

Методи

Експериментите са проведени в съответствие с указанията на Институционалния комитет за грижа и употреба на животните (IACUC) в Медицинския колеж Weill Cornell (WCMC) в съответствие с всички приложими федерални, щатски и местни разпоредби. Всички експериментални протоколи за това специфично проучване бяха одобрени от IACUC (номер на протокол за използване на животни 0705-615A), включително грижи за животните, настаняване и хигиенизиране (WCMC номер за хуманно отношение към животните: D16-00186); Регистрационен номер на лаборатория на Комитета за институционална биобезопасност на IBMC (IBC): IBC-18783.

Животни и лечение

Мъжки мишки от див тип (wt) C57BL/6 (лаборатория Jackson, Bar Harbor, ME) се държат на 12-часови цикли светлина/тъмнина. На 6-седмична възраст те или са били хранени ad libitum с чау-диета с 13% от ккал от мазнини (котка # 5053, 15 IU витамин А-ацетат/грам, Test-Diet, Inc.), или диета с високо съдържание на мазнини (HFD), с 45% от ккал от мазнини (cat # 58125, 4.7 IU витамин А-ацетат/грам, Test-Diet, Inc.). Избрахме тези диети с чау и високо съдържание на мазнини въз основа на доказателства, публикувани преди това от нашата група [18], показващи, че мишки от див тип C57BL/6 са хранили диета с високо съдържание на мазнини (HFD) с 4,7 IU витамин А-естер/грам (# 58125, Test-Diets Co, Сейнт Луис, Мисури) показа еднакво намаляване на нивата на витамин А в тъканите в сравнение с контролните мишки, хранени или с персонализирана контролна диета (# 58124, Test-Diets Co, Сейнт Луис, Мисури), която съдържа 3,8 IU витамин A-естер/грам), или WCMC вивариум диета с гризачи с 15 IU витамин А-естер/грам (Pico Rodent Diet, # 5053) [18]. В настоящото проучване мишките, хранени с HFD в продължение на 3 месеца, бяха разделени на три групи, всяка от които беше третирана за допълнителен месец на HFD с (а) без допълнителни лекарства (носител, 0.6% DMSO); (б) RARα синтетичен агонист, 4 - [(5,6,7,8-тетрахидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафталенил) карбоксамидо] бензоена киселина (AM80) (cat # S4260, партида n .01, Selleck Chem), при концентрация от 0,4 mg/100 ml (

0,6–0,8 mg/kg телесно тегло) в 0,6% DMSO, или (c) синтетичен агонист на RARβ2, 4- (4- (2-бутоксиетокси) -5-метилтиазол-2-ил) -2-флуоробензоена киселина (AC261066) ( cat # 4046, R&D Systems) [20], при концентрация 3 mg/100 ml (5,3 mg/Kg т.т.) в 0,6% DMSO, като двете лекарства се прилагат в питейната вода (n = 4 мишки на група).

Тестове за толерантност към глюкоза (GTT)

След четири месеца лечение и след гладуване през нощта, тествахме кохортите на мишките, за да измерим скоростта на изчистване на кръвната глюкоза. Накратко предизвикахме мишките с инжектиране на 20% разтвор на глюкоза в PBS при 2,0 g/kg телесно тегло (п = 4 мишки на група). Измерихме кръвната глюкоза от вените на опашката на 15, 30, 45, 60 и 120 минути след инжектирането с помощта на Free Style Lite система за мониторинг на кръвната глюкоза (Abbott Diabetes Care, Inc.).

Високопроизводителна течна хроматография (HPLC)

Хистология и патологично изследване

Фиксирахме проби от черен дроб и панкреас в 4% формалдехиден буфер и ги вградихме в парафинови блокове. След това оцветихме 5 μm срезове с хематоксилин и еозин (H&E) и чернодробен патолог (JJ) оцени всяка проба по сляп начин за данни за стеатоза, фиброза и стеатохепатит, въз основа на най-добрата клинична практика и критериите на Brunt [24] . Основните хистопатологични характеристики, разгледани за всеки раздел, включват: дуктуларна реакция (резултат 0–3), портално и лобуларно възпаление (0 - няма, 1 - леко, 2 - умерено, 3 - тежко), наличие или отсъствие на атипични клетки, съставляващи дуктуларната реакция, степен на стеатоза (0-няма, 1 30, но 60%), тип стеатозни вакуоли (микровезикуларна или макро-везикуларна) и балонна дегенерация (0-няма, 1-случайни, 2-повече от случайни, 3-многобройни клетки).

Измервания на серумни триглицериди

За измерване на серумните триглицериди на гладно използвахме ръчен липиден анализатор CardioChek PA и тест ленти за триглицериди PTS (Polymer Technology Systems, Inc., Indianapolis, IN). Проведохме този тест при 4 мишки на група.

Чернодробна екстракция на триглицериди

За да определим количествено чернодробните нива на триглицеридите, използвахме метода на Folch [25] с 4 мишки на група. Екстрахирахме чернодробните липиди (50 mg тъкан) със смес от хлороформ и метанол (съотношение 2: 1). За изсушаване на липидните екстракти използвахме азотен газ, последвано от ресуспендиране в 200 μl изопропанол и количествено определяне с помощта на комплекта Liver Triglycerides (ThermoFisher Infinity Kit, cat # TR22421) върху четец за микроплаки SpectraMax M2e (Molecular Devices, Inc.) според производителите 'протокол.

Имунофлуоресцентна микроскопия

Фиксирахме чернодробни тъкани за една нощ с 4% формалдехид при 4 ° C, последвано от обработка с 25% захароза и вграждане на оптимална температура на рязане (OCT), преди секциониране на криостат. След това блокирахме 3-4 слайда на група с 2% говежди серумен албумин (BSA) в PBS/Triton X 0,1% или коктейл от миши IgG (котка # MKB-2213, партида # ZB0618, разредена 1:30, Vector Labs, Inc.) и блокиращ серум, ако се използват миши антитела, за 1 час при стайна температура (rt). След оптимизиране на протокола за оцветяване, ние инкубирахме предметните стъкла в продължение на 4 часа при 37 ° C с мишка анти-RBP1 (CRBP1) (cat # sc-271208, партида # B0912, 1:50) (Santa Cruz, Inc.) или за една нощ при 4 ° C с плъх-анти F4/80 (Bio Legends, кат. n. 123101, Lot. B226028, 1: 100). За да се оцени неспецифичното оцветяване, включихме слайд с отрицателна контрола, инкубиран без първично антитяло. След изплакване в PBS, ние след това инкубираме предметните стъкла с конюгирани с Alexa Fluor 594 антимиши или Alexa Fluor 488 конюгирани вторични антитела срещу плъхове (Invitrogen), разредени 1: 500, за 1 час при 22 ° C. Оцветихме ядрата с Hoechst Dye 33258 (cat # 382061, Calbiochem) при концентрация от 0,5 μg/mL в PBS за 1 минута, последвано от едно измиване в PBS и монтиране за получаване на изображения.

Придобихме минимум 4 произволни полета на тъканна секция и определихме количествено нивото на флуоресценция с помощта на софтуера Fiji (Image J) (v1.48, NIH) съгласно предварително публикувани критерии [26]. Накратко, изчислихме относителното ниво на флуоресценция като интегрирана плътност– (площ на избраната клетка × средна флуоресценция на фоновите показания). След това данните бяха представени като средно ± стандартно отклонение (SD).

Изолация на РНК и количествена RT PCR (qRT-PCR)

Екстрахирахме обща РНК с TRI реагент (Sigma Aldrich) от черен дроб на мишка (3-4 мишки на експериментална група) и използвахме 1 μg РНК за синтезиране на комплементарна ДНК (cDNA) с произволни праймери. За оценка на нивото на генна експресия използвахме специфични праймери за ретинол свързващ протеин 1 (RBP1) (Gene ID: 19659) Праймер праймер (5’– 3 ’): GCTGAGCACTTTTCGGAACT; Обратен грунд (5’– 3 ’): GGAGTTTGTCACCATCCCAG. Използваният домакински ген е рибозомният фосфопротеин P0 (RPLP0), посочен като 36B4 (ID на гена: 11837) Праймер за праймер (5’– 3 ’): AGAACAACCCAGCTCTGGAGAAA; Обратен грунд (5’– 3 ’): ACACCCTCCAGAAAGCGAGAGT. Извършихме qRT-PCR, както беше описано по-горе [27], използвайки SYBR Green PCR master mix върху Bio-Rad MyiQ2 PCR в реално време iCycler (Bio-Rad). За да изчислим различната генна експресия в експерименталните групи, използвахме метода делта Ct и нормализирахме към експресията на вътрешния контролен ген 36B4 [17].

Статистика

Данните са представени като средно ± стандартно отклонение (SD). Определихме статистическата значимост между групите чрез еднопосочен ANOVA и Bonferroni множествен сравнителен post-hoc анализ (черни звезди), P стойности от фиг. 1. RARα агонистът AM80 не влияе върху телесното тегло на HFD-хранени мишки, но увеличава нива на глюкоза на гладно и непоносимост към глюкоза.

(А) Телесното тегло (телесно тегло) на мишки, които са получили само HFD, HFD + AM80 или HFD + AC261066, са били увеличени в сравнение с мишките, хранени с чау. (Б) Нива на глюкоза на гладно при третирани с HFD, HFD + AM80- и HFD + AC261066 в сравнение с мишки, хранени с чау. (C) Тестове за толерантност към глюкоза (GTT), проведени след гладуване през нощта, с интраперитонеална (ip) инжекция от 20% глюкоза в PBS, при 2 g глюкоза/Kg. (D) Количественото определяне на GTT се представя от площта под графиката на кривата (AUC). Мишки, използвани във всички експерименти = 4 на група. Графиките са представени като средно ± стандартно отклонение (SD). Черните звезди представляват статистическа значимост според еднопосочния тест ANOVA, p Фигура 2. Ретинолът (ROL) се увеличава в серума, а ретинолът и ретинил палмитатът намаляват при третирани с HFD-, HFD + AM80- и HFD + AC261066 в сравнение с мишки, хранени с чау.

Количествено определяне чрез HPLC на серумен ретинол, чернодробен ретинол и чернодробен ретинил палмитат при мишки, третирани с чау, HFD-, HFD + AM80- и HFD + AC261066. Графиките са представени като средно ± стандартно отклонение (SD). Мишки на група = 4; Черните звезди представляват статистическа значимост според еднопосочния тест ANOVA, р 0,05) и 9,3 пъти (± 1,4) (р> 0,05) по-ниски, съответно от тези при мишки, хранени с чау (Фигура 3), докато нивата на RBP1 протеин в третирани с HFD + AC261066 мишки са> 18 пъти (± 1) (р 0,05). За разлика от това, не наблюдаваме промени в нивата на RBP1 mRNA при мишки, третирани с HFD + AM80, в сравнение с тези при мишки, третирани с HFD (Фигура 3).

Представителни изображения, изобразяващи RBP1 в червено и ядра в синьо (етикетиране на Hoechst), оценени чрез имунофлуоресценция в замразени чернодробни тъкани и чрез qRT-PCR при мишки, третирани с chow-, HFD-, HFD + AM80- и HFD + AC261066. Жълтите стрелки на изображенията показват представителни области на RBP1-позитивност (вложки). Количественото определяне на нивата на имунофлуоресценцията и тРНК е представено като графика. Графиките са представени като средно ± стандартно отклонение (SD) (мишки на група = 3-4; полета на изображението на мишка> 4). Статистическата значимост се оценява от еднопосочен ANOVA (черни звезди), p Фигура 4. RARα-синтетичният агонист AM80 увеличава стеатозата при HFD-хранени мишки.

Количествено определихме съдържанието на триглицериди в черния дроб, както е описано в раздела Методи [25], и установихме 2,8-кратно (± 0,14) (р 0,05) увеличение, съответно, в сравнение с мишките, хранени с чау (Фигура 5).

Предвид нарастващия набор от данни, демонстриращи ролята на ретиноидите в патофизиологията и лечението на нарушения, свързани със затлъстяването, различните метаболитни ефекти на специфичните за RARα и RARβ2 агонисти AM80 и AC261066, представени в тази работа, засилват терапевтичния потенциал на ретиноидите, но, също важно е също така да се подчертае необходимостта от по-нататъшни предклинични проучвания за определяне на терапевтичната значимост и потенциалните ограничения на изотип-специфичните RAR агонисти при лечението на NAFLD и други нарушения, свързани със затлъстяването.

Подкрепяща информация

S1 Фиг. RARα агонистът AM80 и RARβ2 агонистът AC261066 не засягат серумните триглицериди.

Серумните триглицериди на гладно в мишки, третирани с чау, HFD, HFD + AM80 и HFD + AC261066 (4 мишки на група). Мишките бяха третирани както на фиг. 1. Серумните триглицериди бяха измерени, както е посочено в раздела Методи. н.с. = незначително (p> 0,05).

Благодарности

Благодарим на лабораторията Gudas за дискусия и критично тълкуване на данните.