Катедри по медицина, Медицински център на университета Хадаса-Еврей, Йерусалим, Израел

Автор за кореспонденция: Цви Акерман, Катедра по медицина, Медицински център на университета Хадаса-Еврей, кампус на планината Скопус, П.О. Box 24035, Йерусалим 91240, Израел (факс +972 2 5823515,

Катедри по медицина, Медицински център на университета Хадаса-Еврей, Йерусалим, Израел

Ort Braude Engineering College, Karmiel, Израел

Институт по химическа патология, Медицински център Шеба, Тел Хашомер, Израел

Институт по химическа патология, Медицински център Шеба, Тел Хашомер, Израел

Катедри по медицина, Медицински център на университета Хадаса-Еврей, Йерусалим, Израел

Автор за кореспонденция: Цви Акерман, Катедра по медицина, Медицински център на университета Хадаса-Еврей, кампус на планината Скопус, П.О. Box 24035, Йерусалим 91240, Израел (факс +972 2 5823515,

Катедри по медицина, Медицински център на университета Хадаса-Еврей, Йерусалим, Израел

Ort Braude Engineering College, Karmiel, Израел

Институт по химическа патология, Медицински център Шеба, Тел Хашомер, Израел

Институт по химическа патология, Медицински център Шеба, Тел Хашомер, Израел

Резюме

Безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) е най-разпространеното хронично чернодробно заболяване. Световното разпространение на NAFLD продължава да нараства с нарастващата епидемия от затлъстяване (прегледано в 1). Най-честият рисков фактор за NAFLD е наличието на метаболитен синдром, който включва коремно затлъстяване и две или повече от следните характеристики: високо кръвно налягане, повишени нива на глюкоза и триглицериди на гладно или ниски плазмени нива на HDL холестерол. NAFLD се счита за чернодробната проява на метаболитния синдром (прегледана в 2).

Натрупващите се данни от проучвания при хора и животни показват, че нарастващото разпространение на NAFLD е свързано с нарастващия прием на прости захари, особено фруктоза (прегледани в 3, 4). Консумацията на фруктоза за дълги периоди може да предразположи животните и индивидите към чернодробна мастна инфилтрация и метаболитен синдром 3-7. През последните години потреблението на фруктоза, която се използва в хранителната промишленост като подсладител, неимоверно се е увеличило 4 .

Към момента множество патофизиологични механизми, включително дефицит на мед, са свързани между увеличената консумация на фруктоза и развитието на NAFLD 4, 8-12 .

Медта е микроелемент, който е от съществено значение за функцията на няколко ензима, участващи в различни биологични процеси. Изследвания, проведени през последните десетилетия в Обединеното кралство и в САЩ, потвърдиха, че съдържанието на мед в различни хранителни продукти (като месо, плодове и зеленчуци) намалява. Изчислено е, че в резултат на намаленото потребление на мед, голяма част от населението на Запада е склонна да развие дефицит на мед и свързаните със здравето проблеми (прегледани в 12, 13). Известно е, че дефицитът на мед влияе върху сърдечно-съдовата, мускулно-скелетната и нервната система, причинява различни хематологични нарушения, нарушава функцията на имунната система, нарушава метаболизма на холестерола и глюкозата и влияе върху функцията на чернодробната антиоксидативна система (прегледано в 12, 13).

В предишни публикации от нашата група бяха представени характеристиките на модела на плъхове с обогатена с фруктоза диета (FED) за NAFLD, който не е затлъстяване 5, 14. Плъховете FED развиват чернодробни макро- и микровезикуларни мастни натрупвания, увеличаване на чернодробното съдържание на триглицериди и холестерол и увеличаване на чернодробния оксидативен стрес и дефекти в чернодробните антиоксидативни пътища 5, 14-16. Моделът FED за плъхове също се характеризира с няколко аспекта на метаболитния синдром, които включват инсулинова резистентност, хипертриглицеридемия и хипертония 5, 14-16. Лекарства за намаляване на хипертония (амлодипин или каптоприл) или плазмени триглицериди (безафибрат), причинени в допълнение към очакваното намаляване на кръвното налягане и плазмените триглицериди, също неочаквани промени в чернодробната хистология, серумни чернодробни ензими, серумни и чернодробни липиди, инсулинова резистентност, чернодробно желязо концентрация (HIC), промени в чернодробната окислителна, антиоксидативна среда и също така промени в апоптозата на спленоцитите 5, 14-17 .

Целите на настоящата работа бяха да се характеризират промените в плазмената и чернодробната концентрация на мед при плъхове, получаващи FED със и без фармакологични манипулации за намаляване на кръвното налягане или плазмените триглицериди. Промените в чернодробните концентрации на мед са свързани с промените, наблюдавани в имунохистохимичната чернодробна експресия на медно-цинково-супероксиддисмутаза (CuZnSOD: SOD1), металотионеин (MT) и нитротирозин (NITT), настъпили в различни групи плъхове.

Материали и методи

Животни

В това проучване бяха анализирани чернодробни и плазмени проби, архивирани от животни, които са изследвани в предишното ни проучване 5. Изследвани са тридесет мъжки плъха Sprague-Dawley (Harlan Laboratories Ltd., Йерусалим, Израел) с тегло 200 ± 20 грама. Плъховете бяха настанени в редовни клетки, разположени в стая за животни при 22 ° C, с 14‐/10-часов цикъл светлина/тъмнина. Плъховете се поддържат на стандартна диета с плъхове (гранули # 19520; Koffolk, Тел Авив, Израел) и им се дава питейна вода за пиене ad libitum. Всички процедури, извършени с животни, са били в съответствие с указанията на Медицинския център Sheba за изследвания върху животни и одобрени от Институционалния комитет по етика на животните.

В началото на проучването плъховете бяха разделени на случаен принцип в пет групи (шест плъха във всяка група). Едната група продължава да бъде поддържана на стандартна диета с плъхове в продължение на 5 седмици, докато на останалите четири групи е даван FED (TD 89247 - Harlan Teklad, Madison, WI, USA) за 5 седмици. FED съдържа (както се доставя от Harlan Teklad) 20,7% (на база тегло) протеин (като казеин), 5% мазнини (като свинска мас), 60% въглехидрати (като фруктоза), 8% целулоза, 5% минерална смес, R‐ Н (# 170760) и 1% витаминен микс, Teklad (# 40060). Диетата TD 89247 съдържа 30 mg мед (като меден сулфат) в 1 kg диета. Стандартната диета с плъхове, съдържаща (както се доставя от Koffolk), 21,9% протеини, 4,5% мазнини, 41% нишесте, 5% захар и 3,7% сурови фибри. Стандартната диета с плъхове съдържа 10 mg мед (като меден сулфат и меден карбонат) в 1 kg диета. И двете диети се доставят под формата на гранули.

Три седмици след започване на FED (когато всички компоненти на метаболитния синдром вече са налице), на три от четири групи плъхове са дадени допълнителни фармацевтични интервенции за 2 седмици. На една група е даден амлодипин (15 mg/kg на ден; Pfizer, Ню Йорк, Ню Йорк, САЩ), на друга група е даден каптоприл (90 mg/kg на ден; Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО, САЩ) и на третата група е даден безафибрат (10 mg/kg дневно; Roche Diagnostics GmbH, Базел, Швейцария). Всички лекарства се разтварят в 0,5 ml етанол, разреждат се и се прилагат в питейната вода. Приемът на вода беше ограничен до 125 ml за пет животни на ден, през последните 2 седмици от експеримента, за да се осигури пълна доза на приложение на лекарството и еднаква консумация на вода във всички групи. Съобщава се, че дозите на лекарствата, използвани в това проучване, са ефективни за намаляване на хипертонията и за понижаване на плазмения триглицерид 5. Обобщение на схемата на изследването, видовете диети и лекарствата, предоставени на изследваните групи, са представени в таблица 1.

Седмици 1, 2 и 3 Седмици 4 и 5
Група 1 (n = 6) Само диета с чау Само диета с чау
Група 2 (n = 6) Само диета, обогатена с фруктоза Само диета, обогатена с фруктоза
Група 3 (n = 6) Само диета, обогатена с фруктоза Обогатена с фруктоза диета + амлодипин
Група 4 (n = 6) Само диета, обогатена с фруктоза Обогатена с фруктоза диета + каптоприл
Група 5 (n = 6) Само диета, обогатена с фруктоза Обогатена с фруктоза диета + безафибрат

В края на „периода на фармакологична интервенция“ плъховете бяха убити. Черните им дробове бяха събрани и претеглени. Две порции от всяка чернодробна тъкан бяха фиксирани във фосфатно буфериран формалдехид. Единият е вграден в парафин, а другият е използван за определяне на концентрацията на чернодробна мед.

Определяне на чернодробната и плазмената концентрация на мед

Определянето на чернодробната и плазмената концентрация на мед се определя с помощта на атомно-абсорбционен спектрометър. Резултатите от концентрациите на мед са изразени като μg на грам суха чернодробна тъкан и като μg/dl за плазма. Подробности за цялата процедура са представени другаде 18 .

Имунохистохимия и анализ на изображения

Чернодробните тъкани, фиксирани с формалин, вградени в парафин, бяха разделени на 5 μm. Депарафинизираните, рехидратирани срезове се подлагат на следните процедури последователно: индуцирано от топлина извличане на епитоп в цитратен буфер, блокиращо от 3% пероксид и фонов разрушител (INNOVEX, Ричмънд, Калифорния, САЩ). Заешки анти-нитротирозин (EEMD Millipore Corporation, Billerica, MA, САЩ), разреден 1: 200; Заек анти-SOD-1, (Proteintech, Чикаго, IL, САЩ), разреден 1: 100; и Миши моноклонален антиметалотионеин (кръстосано реагира с MT1 и MT2; DAKO, Дания), разреден 1: 100, бяха приложени през нощта при 4 ° C. Антителата бяха открити с ZytoChem Plus HRP Polymer anti-Mouse (ZYTOMED, ​​Германия), последвано от диаминобензидин тетрахидрохлорид [DAB Chromogen System (SIGNET), Covance, England], съгласно стандартните процедури. Всяка процедура на оцветяване включва отрицателни контроли. Секциите бяха леко оцветени с хематоксилин на Mayer и монтирани в EUKITT.

Експресията на протеин (за SOD1, MT и NITT) се оценява чрез измерване на оптичния интензитет на имунопозитивността на чернодробните клетки (в пиксели), в 3 полета от 3 чернодробни лобули, в чернодробна тъкан, разположена около централните вени (девет полета за всяко животно). Анализът на изображенията беше извършен с помощта на модифициран подход в софтуера imagej. Хистологичната оценка на чернодробните секции се извършва сляпо (от GS).

Статистическа оценка

Данните са представени като средно ± стандартна грешка (S.E.M.). Сравненията между групите бяха извършени с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ (anova) с тест за множество сравнения на Tukey – Kramer или, когато е необходимо, с теста Kruskal – Wallis (непараметрична anova). стр ≤ 0,05 се счита за статистически значимо.

Резултати

Установено е, че черният дроб на плъховете FED има леки до умерени макро- и микровезикуларни чернодробни мастни инфилтрати и много лека синусоидална фиброза 5. Прилагането на FED е свързано с 2.2-кратно намаляване на чернодробните концентрации на мед (стр 5 и в чернодробните концентрации на мед. Приложението на каптоприл при FED плъхове причинява 50% намаление на макровезикулярните чернодробни мастни инфилтрати 5, но няма промени в концентрациите на мед в черния дроб. Приложението на безафибрат при плъхове FED причинява 90% намаление на чернодробните макровезикуларни чернодробни инфилтрати, но без промяна в микровезикулярните мастни инфилтрати, възпалителен или фиброзен резултат 5 Прилагането на безафибрат върху плъховете FED възстановява концентрациите на чернодробна мед до нива, които се наблюдават в групата на чау (контролна) (фиг. 1). Не са наблюдавани промени в плазмените концентрации на мед сред различните изследователски групи (фиг. 2). Приложението на FED намалява чернодробната експресия на SOD1 (стр

понижаващите

Обогатеното с фруктоза хранене причинява изчезване на чернодробната експресия на МТ. На фолиото на плъховете FED се забелязва само зацапване на фона. Прилагането на амлодипин при FED плъхове не е свързано с по-нататъшни промени в чернодробната експресия на МТ. Прилагането или на каптоприл, или на безафибрат на FED плъхове е причинило значително увеличение на чернодробната експресия на МТ (стр

Обогатената с фруктоза диета е свързана с увеличаване на чернодробната експресия на NITT (стр

Дискусия

В настоящото проучване демонстрирахме, че плъховете на Sprague-Dawley, които са били на 60% FED и са развили NAFLD с характеристики на метаболитния синдром, са намалили чернодробните концентрации на мед, намалената експресия на чернодробните антиоксидативни протеини, които се регулират от мед (SOD1 и MT ) и повишена чернодробна експресия на маркер за оксидативен стрес (NITT).

Връзката между чернодробния дефицит на мед и NAFLD е съобщена по-рано 8-12. Установено е, че лица с NAFLD имат по-ниски концентрации на мед в черния дроб, отколкото контролните индивиди 9, 10. Освен това е установено, че пациентите с по-напреднала форма на NAFLD (неалкохолен стеатохепатит) имат по-ниски чернодробни концентрации на мед, отколкото пациентите с по-слабо напреднала форма на NAFLD (проста стеатоза) 8, 9 .

Предложени са няколко патофизиологични механизма за връзка между дефицита на чернодробна мед и NAFLD. Те включват увеличаване на производството на чернодробни триглицериди и повишаване на плазмените концентрации на холестерол и триглицериди и потискане на чернодробната антиоксидативна система и увеличаване на HIC.

Съобщава се, че ограничаването на хранителната мед при експериментални животни повишава плазмения холестерол и триглицеридите 19. Освен това се съобщава, че храненето с фруктоза на плъхове с дефицит на мед причинява допълнителни увеличения на плазмения холестерол и плазмените и чернодробните концентрации на триглицериди и по този начин преувеличава чернодробното възпаление 20, 21. Предполага се, че диетичната фруктоза, в допълнение към метаболитните си ефекти, може също да наруши абсорбцията на мед в червата, като инхибира медния транспортер, разположен в дванадесетопръстника и проксималната йеюнум 10, 22 .

В настоящото проучване беше открита уникална находка: прилагането на безафибрат на FED плъховете е свързано с повишаване на чернодробните концентрации на мед. Други вече съобщават, че приложението на фибрати при плъхове води до увеличаване на концентрацията на чернодробна мед 23. Все още не е изяснено как приложението на фибрати е повишило концентрацията на мед в черния дроб.

Констатациите от настоящото проучване са в съгласие с тези, които са докладвани по-рано; намаляване на експресията на SOD1 в черния дроб се наблюдава при дефицитни на мед FED плъхове. Освен това е установена значителна корелация между стойностите на чернодробните концентрации на мед и стойностите на експресията на SOD1 в черния дроб на всяко животно, което е участвало в изследването. Приложението на безафибрат, в допълнение към ефекта му върху концентрацията на чернодробна мед, може също да подобри чернодробната функция 26. В предишна публикация от нашата група беше съобщено, че при тези FED плъхове с NAFLD е настъпила и редукция на експресията на SOD2 ген и протеин 16. Подобно на настоящия доклад, приложението на безафибрат възстановява генната и протеинова експресия на SOD2 до изходните нива 16. Констатациите за намалена чернодробна експресия както на SOD1, така и на SOD2 при тези плъхове чрез приложение на FED и възстановяването на чернодробната експресия на двата ензима чрез безафибрат повишават възможността чернодробното увреждане, в допълнение към дефицита на мед, да е отговорно и за намаляването на чернодробна експресия на SOD1.

Няколко проучвания съобщават, че при индивиди и експериментални животни, които поглъщат FED и са с дефицит на мед, се увеличава HIC 8-11. Увеличението на HIC при лица с дефицит на мед е свързано с повишена абсорбция на дуоденално желязо и/или нарушен износ на желязо от черния дроб 8-11, 35, 36. Предполага се, че повишеният HIC може да медиира увеличаването на чернодробния оксидативен стрес и прогресията на NAFLD 8-11. Въпреки това, както беше споменато по-рано, не успяхме да демонстрираме някакво увеличение на HIC при плъховете FED, които развиха NAFLD 5 .

Нашето проучване има няколко ограничения: (а) определянето на концентрациите на чернодробна мед в това проучване се извършва в архивирани чернодробни тъкани, които са фиксирани във фосфатно буфериран формалдехид. Съобщава се обаче, че определянето на концентрацията на чернодробна мед в тъкани, които са били обработени чрез фиксиране на формалин или съхранявани години в парафинови блокове, е толкова надеждно, колкото измерванията, извършени в пресни чернодробни тъкани 37. (б) Поради естеството на нашето изследване (анализ на архивирани чернодробни и плазмени проби), не успяхме да извършим надеждни техники за молекулярна биология, а само имунохистохимичен анализ за изследване на промените, настъпили в чернодробната експресия на SOD1, MT и NITT като резултат от различните фармакологични манипулации.

Патогенезата на NAFLD при индивиди, които консумират фруктоза, е сложна. В това проучване беше показано, че FED плъховете с NAFLD имат ниски чернодробни концентрации на мед. Намалените чернодробни концентрации на мед могат да допринесат за потиснатия чернодробен антиоксидативен капацитет на тези плъхове и по този начин вероятно са играли ролята на „второ попадение“ в прогресията на NAFLD. Подобряването на индуцираната от FED NAFLD при плъхове, които са получавали безафибрат, е могло да бъде отчасти поради увеличаването на чернодробните концентрации на мед, индуцирани от безафибрат. Необходими са допълнителни проучвания, за да се разбере дали хранителните добавки с мед при лица с NAFLD могат да подобрят чернодробните им заболявания.