• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: [email protected]

Редактирано от Alan R. Fersht, MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK, и одобрено на 30 май 2012 г. (получено за преглед на 1 март 2012 г.)

чрез

Резюме

Резултати и дискусия

Протеини.

Кристални структури и фибрилни морфологии на изследваните варианти на apoSOD1. Мономерът apoSOD1 с непокътната кръстосана връзка C57 – C146 (apoSOD1 C57 – C146), съответният протеин в TCEP с редуцирани части C57 и C146 (apoSOD1 SH SH) и вариантът с контури IV (зелен) и VII (син), отстранен от протеин инженерство (apoSOD1 ΔIV ΔVII). Структури, изградени от PDB запис 2XJK. ЕМ микроснимките на съответните протеинови фибрили, получени чрез разбъркване в чист pH буфер 6,3 при 37 ° C. Скалите са 200 nm.

Настройка на сгъваемото равновесие.

Тогава въпросът е до каква степен цевта SOD1 трябва да се скъса - или да се разгъне - за да стане компетентна за мъждене. За да разберем, ние постепенно дестабилизирахме структурата на SOD1 чрез титруване на урея, като същевременно измервахме отговора върху кинетиката на агрегиране. Определянето на концентрациите на местни (N) и разгънати видове (D) при всяка концентрация на урея беше чрез стандартен анализ на две състояния (12, 21, 22, 24, 25).

Данни за сгъване и трептене. (A) Шевронни графики на apoSOD1 C57 – C146, apoSOD1 SH SH и apoSOD1 ΔIV ΔVII, показващи припадъци на log kf и log ku [Eq. 8]. Изкривяванията в разгъващите се крайници при високо [урея] се дължат на промени в състоянието на преход или износване на местното състояние и бяха изключени от пристъпите. Пунктираната линия показва концентрацията на урея, където D достига пълна заетост. Единиците са в s -1. (B) Концентрация на D в анализите на фибрилация, изчислена от данните на chevron на apoSOD1 ΔIV ΔVII. Общата концентрация на протеин е 25 μM, а мерните единици са в М. (C) Време на закъснение на фибрилация (τlag) на apoSOD1 ΔIV ΔVII спрямо [урея] (отворени кръгове), получени от курсове на време на фибрилация, както е описано в SI Текст, Анализ на фибрилацията Курсове по време. Вътрешната [урея] зависимост на log τlag е измерена при пълно заемане на глобално разгънато състояние (D) над 4 M урея. Изваждането на тази зависимост от [урея] води до пряката връзка между log τlag и log [D] (затворени кръгове). При тези условия ∂ log τlag/∂ [урея] = mτlag = 0,13 ± 0,06. Единиците са в s. (D) Съответни данни и процедура за нормализиране на константите на скоростта на удължаване (νmax) на apoSOD1 ΔIV ΔVII. ∂ log νmax/∂ [урея] = mν max = -0,17 ± 0,05. Единиците са в s -1 .

Кинетични параметри и стабилност на протеините. Константите на скоростта са в единици s -1

Проверка на поведението на две държави чрез хетеронуклеарна единична квантова корелация (HSQC) NMR.

Отчитане на зависимостта от урея на кинетиката на мъждене.

Доказателства за подпомагане на фрагментацията.

Времето на забавяне на фибрилацията (log τlag) и константата на скоростта на удължаване (log νmax) показват линейни зависимости от логаритмизираната концентрация на глобално разгънат apoSOD1 ΔIV ΔVII (log [D]). Съответстващите наклони на ∂ log τlag/∂ log [D] = -0,47 ± 0,03 и ∂ log νmax/∂ log [D] = 0,56 ± 0,03 предполагат механизъм за подпомагане на фрагментацията според уравненията. 3 и 5. Графики на log τlag спрямо log νmax и τlag срещу νmax (Inset). Данни от титруване на урея (затворени кръгове) и мутагенеза (отворени кръгове).

Зависимост на карбамид и фибрилация m-стойности.

За да хвърлим допълнителна светлина върху процеса на фибрилация apoSOD1 ΔIV ΔVII, използвахме зависимостите от карбамид на νmax и τlag, които отразяват промените в повърхността, достъпна за разтворител, на основните стъпки на микроскопичната реакция. От денатурираните базови линии на фиг. 2 получаваме ∂ log νmax/∂ [урея] = mν max = -0,17 ± 0,05 и ∂ log τlag/∂ [урея] = mτlag = 0,13 ± 0,06 (фиг. 2). Съответстващите абсолютни стойности на mνmax и mτlag допълнително подкрепят съществуването на общ мащабиращ фактор κ, както се извежда в уравнения. 4 и 5. Важното е, че този коефициент на мащабиране ни позволява да изследваме микроскопичните константи на скоростта k + и k- в същата концептуална рамка като кинетиката на сгъване (фиг. 4). Резултатите от такова изследване са описани в SI Text, Фибрилация m-стойности и предполагат, че 30–50% от SOD1 ΔIV ΔVII последователността (т.е. 2 до 4 β-нишки) се заравя във фибрилната структура, в зависимост от позицията на удължителна бариера (‡ удължаване) по m -/+ (фиг. 4). Интересното е, че тази оценка е в добро съгласие с предишни данни от масова спектроскопия, които показват фибриларни сегменти от 3 до 5 β-нишки (6). За тази цел относително ниските стойности на mν max и mτlag показват, че постоянният растеж на SOD1 фибрили при високо [урея] не трябва да предполага изключителна стабилност на продукта, но може да произтича и от ниска чувствителност към денатурант.

Схематична илюстрация на раздвоените сгъваеми и фибрилационни профили на свободна енергия на apoSOD1 ΔIV ΔVII. Координатата на реакцията е достъпна за разтворител повърхност, измерена чрез m-стойностите в таблица 1 и SI текст, m-стойности на фибрилация. Профилите показват случая, когато преходните състояния на сгъване и трептене (‡ сгъване и ‡ удължаване) са разположени симетрично. За простота стабилността на фибриларното състояние (A), разгънатият мономер (D) и сгънатият протеин (N) се нормализират и височините на бариерите не трябва да се мащабират. I * е високоенергийният междинен продукт, наблюдаван от ЯМР при 0 M урея (16, 23).

Мутационен анализ чрез електронно сканиране.

Изследване на кинетиката на фибрилиране apoSOD1 ΔIV ΔVII чрез Е-сканиране при напълно денатуриращи условия при 5 М урея. (А) Хистограми на мутантни времена на забавяне (τlag), снабдени с ненормирани гама разпределения (Таблица 2). Псевдо-див тип (черен) и мутанти (червен и зелен). (Б) Последователни позиции на Е мутации. (C) Структурни позиции на E мутации (оранжево). Положително и отрицателно заредени странични вериги са показани съответно в синьо и червено.

Корелациите между времената на закъснение на фибрилацията (τlag) и параметрите нетен заряд и хидрофобност се променят. (A) τlag показва обща линейна зависимост от нетния заряд, съобразена с общото поведение на протеин-протеиновите взаимодействия, съгласно Схема 2 (34). ApoSOD1 ΔIV ΔVII (-3), E-сканиращи мутанти (-4 до -6) и apoSOD1 C57 – C146/apoSOD1 SH SH (-8). (B) Парцел на τlag за мутанти apoSOD1 ΔIV ΔVII с нормализиран нетен заряд от -5 срещу промяна в локалната хидрофобност (Таблица 2). Изключителната е мутацията β1 V5E/V7E, която е уникална, като няма ефект върху τlag. R-стойността от 0,85 е без измерването на β1.

Параметри за кинетиката на фибрилация при 5 M урея

Обобщение и заключения.

Материали

Мутагенеза, експресия, пречистване и експериментални условия.

Мутагенезата, експресията и пречистването бяха както в (22, 23) и всички експерименти бяха проведени при 37 ° C в 10 mM Bis-Tris при pH 6.3, освен ако не е посочено друго.

Електронна микроскопия.

Покрити с въглерод медни решетки от 200 меша бяха приложени върху 20 μL капчици фибрилен препарат и попити в продължение на 5 минути. Оцветяването беше с 1% (тегло/обем) уранилацетат. Изображения с увеличение 18 000 × са записани в микроскоп Tecnai G 2 Spirit BioTWIN с волфрамова нишка, работеща при 80 kV.

Сгъваема кинетика.

Крайната концентрация на протеин е 4 μM и степента на урея е ултрачиста (MP Biomedicals, Inc.). Кинетичните измервания бяха на апарат със спиран поток PiStar-180 (Applied Photophysics, Leatherhead, UK) или чрез ръчно смесване на спектрометър Varian Cary Eclipse (Санта Клара, Калифорния), с възбуждане при 280 nm и емисия, събрана с дължина 305 nm -пропусклив филтър или с монохроматор при 360 nm. Намаляването става чрез добавяне на 2.0 mM Tris (2-карбоксиетил) фосфин (TCEP) към всички буфери и инкубация през нощта. Данните на Chevron са снабдени с [8], където kobs е наблюдаваната константа на скоростта и параметрите, определени в уравнения. 1 и 2. Анализът на данните беше с KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA).

Кинетика на фибрилация.

Фибрилацията беше измерена при 37 ° С в стандартни кювети от 3,5 ml кварти в спектрометър Varian Cary Eclipse (Санта Клара, Калифорния) с покрити с тефлон магнитни бъркалки при 1800 об/мин. Обемът на пробата е 2 ml и съдържа 25 μM протеин и 20 μM ThT в 10 mM Bis-Tris при рН 6,3 и варираща [урея]. Намаляването е с 0,5 тМ TCEP. Възбуждането на ThT беше при 444 nm и излъчване при 485 nm и се измерва на всеки 300 s от инкубацията. Обработката на данните беше чрез стандартни процедури, както е описано в SI Text, Анализ на курсовете на време на фибрилация.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства от Шведския съвет за научни изследвания, фондация Кнут и Алис Валенберг, фондация Бертил Халстен и Hjärnfonden. Тази работа беше подкрепена и от Дейността за достъп до научноизследователски инфраструктури в 7-ма рамкова програма на ЕК (Проект № 261863, Bio-NMR) за провеждане на изследванията в CERM. Благодарим на Даниел Шаал и Ингрид Калоун за ранните приноси в този проект.

Бележки под линия

  • ↵ 1 До кого трябва да се адресира кореспонденция. Имейл: mikael.olivebergdbb.su.se .