Транслационна медицина

Тази статия е част от изследователската тема

Многозадачни биомолекули в човешките патологии: известни играчи на неочакваните си пътувания Вижте всички 6 статии

Редактиран от
Клаус Т. Прайснер

Университет в Гисен, Германия

Прегледан от
Zhengzhao Liu

Болница Xiangya, Централен южен университет, Китай

Сяогуанг Ли

Болницата Джон Хопкинс, Медицина Джон Хопкинс, САЩ

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

frontiers

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • Катедра по хепатобилиарна и панкреатична хирургия II, Трета болница Xiangya, Централен южен университет, Чангша, Китай

Въведение

Появата и развитието на остър панкреатит (АП) са в центъра на научните изследвания в областта на хирургията (1). Състоянието на AP, особено тежък остър панкреатит (SAP), е опасно и има висока смъртност (2). В ранния стадий на AP, активираните панкреатични ензими, излишните свободни радикали на кислород и провъзпалителните цитокини причиняват увреждане и смърт на ацинарните клетки (3). Видовете смърт в ацинарните клетки по време на SAP включват апоптоза, некроза и пироптоза (4). Когато ацинарните клетки са предимно апоптотични, клиничните прояви са лек оточен панкреатит, който има добра прогноза (5). Когато са повредени от пироптоза, ацинарните клетки се разкъсват и освобождават клетъчното съдържание и възпалителни фактори, като фактор на некроза на тумора алфа (TNF-α) и IL-1β, влошавайки възпалителния отговор (6). Следователно този режим на ацинарна клетъчна смърт винаги е бил гореща точка в изследванията на AP.

Предишно проучване показа, че морфологията на ацинарните клетки по време на AP има характеристиките на пироптоза (7). Пироптозата е медиирана от каспаза-1/4/5/11 програмирана клетъчна смърт (8). Активирането на каспаза-1 също присъства и в AP ацинарните клетки, което предполага, че пироптозата е свързана с AP (7). Разбирането на механизмите на пироптозата в ацинарните клетки ще помогне да се дадат нови идеи за клинична диагностика и лечение на AP.

Кръговите РНК (circRNAs) са клас РНК с уникална структура със затворен цикъл, които са стабилно експресирани в много биологични клетки (9). Изследванията са установили, че circRNAs могат да регулират нивата на генна експресия на различни нива чрез свързване с miRNAs и протеини и регулиране на протеиновия транслация и модификация и са включени в много биологични процеси, като клетъчна диференциация, пролиферация и апоптоза (10, 11). Следователно, circRNAs играят важна регулаторна роля в развитието на заболявания, като сърдечно-съдови заболявания, тумори и автоимунни заболявания (12). Например, circRNA каспаза-1-свързаната circRNA (CACR) е регулирана в кардиомиоцити, третирани с високо глюкоза. Заглушаването на CACR инхибира активираната от каспаза-1 висока глюкоза и пироптозата в кардиомиоцитите (11), което предполага, че circRNAs са свързани с пироптоза.

В това проучване се фокусирахме върху ролята и основния механизъм на circHIPK3 в AP. circHIPK3 (hsa_circ 0000284) е кръгова РНК, получена от втория екзон на HIPK3 гена. circHIPK3 е силно експресиран в черния дроб, мозъка и белите дробове (13–15) и е показал важна роля в регулирането на клетъчното оцеляване, окислителното увреждане и възпалението (16–18). Отбелязваме, че circHIPK3 се експресира и в панкреатичната тъкан (19). Освен това е показано, че заглушаването на circHIPK3 инхибира освобождаването на IL-1β и TNF-α, което показва тясна връзка между circHIPK3 и възпалението в AP (20). Ролята и механизмът на circHIPK3 в AP обаче остават неясни. В това проучване нашите резултати показват, че circHIPK3 е силно експресиран в серума на пациенти с AP и в стимулирани от церулеин AR42J клетки. В допълнение, демонстрирахме, че заглушаването на circHIPK3 атенюира медиираната от церулеин пироптоза в клетки AR42J. Освен това, механистичното проучване показа, че circHIPK3 насърчава пироптозата и възпалението чрез регулиране на оста miR-193a-5p/GSDMD в клетки AR42J. Следователно, circHIPK3 може да се превърне в нов биомаркер и терапевтична цел в AP.

Материали и методи

Човешка проба

През периода от март 2017 г. до декември 2018 г. в проучването са включени общо 72 пациенти с остър панкреатит (50 мъже и 22 жени; възраст: 30–72 години; средна възраст: 48,3 години). Диагностичният критерий на диагнозата AP е да отговаря на двете от следните условия: (1) остра, постоянна, тежка и непоносима болка в горната част на корема, често излъчвана към гърба; (2) активността на серумната амилаза и/или липаза е три или повече пъти по-висока от нормалната горна граница; (3) засилената CT/MRI или ултразвукова диагностика на коремната кухина показват промени в изображенията на AP.

Диагностичните критерии за диагностика на MAP трябва да отговарят на горната AP диагноза и едно от следните условия: (1) няма органна дисфункция, няма усложнения, Ranson резултат 6 AR42J клетки бяха засяти в 6-ямкови плаки до 80% сливане и след това трансфектирани. За да се насочат селективно към circHIPK3, shRNA последователностите на circHIPK3 са проектирани в кръстовището от глава до опашка (backsplice junction), за да се избегне допълнително сдвояване с линейната иРНК (7-mer семена, които не присъстват в линейния ген на гостоприемника). Контролната последователност беше съпоставена на единия край на кръстовището на връзката, а на другия край беше несъответстваща. Използваната в това проучване shRNA последователност е синтезирана от GenePharma (Шанхай, Китай) и е пакетирана в лентивирусен вектор hU6-MCS-PGK-EGFP (GenePharma, Шанхай, Китай). Множествеността на инфекцията е 100. Ефективността на трансфекцията се определя чрез поточна цитометрия FACScalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) с ефективност на трансфекция над 90%. За miRNA инхибитор и мимична трансфекция, miR-193a-5p инхибиторът и мимиката са закупени от Guangzhou Ribo Biotech (Гуанджоу, Китай) и трансфектирани в съответствие с инструкциите на производителя.

Количествена полимеразна верижна реакция

Общата РНК се екстрахира от клетките и след това се транскриптира обратно, за да се получи комплементарна ДНК (cDNA), използвайки комплект с висока капацитет за обратна транскрипция (Applied Biosystems, Калифорния). CDNA на miRNA е генерирана с помощта на TaqMan miRNA комплект за обратна транскрипция (Applied Biosystems, Фостър Сити, Калифорния, САЩ). Впоследствие qPCR беше използван за откриване на експресията на circHIPK3, HIPK3 и GSDMD чрез комплект за откриване на ген TaqMan, или експресия на miR-30a, miR-124 и miR-193a-5p бяха използвани с помощта на TaqMan Universal Master Mix II. Тъй като кръговата РНК е устойчива на RNase R, използвахме лечение с RNase R, за да намалим ефекта на линейните PCR продукти върху кръговата РНК. GAPDH и U6 бяха използвани като вътрешен контрол съответно за РНК и miRNA. Използвани са следните праймери: circHIPK3, напред 5′-TGGAGACTGGGGGAAGATGA-3 ′ и обратен 5′-CACACTAACTGGCTGAGGGG-3 ′; HIPK3, напред 5′-GACCTGAGGAGATCAAGCCG-3 ′ и обратен 5′-ACTCCTCACTCTTGCGCTTC-3 ′; GSDMD, напред 5′-CTCGCCGACTTCCGTAAACT-3 ′ и обратен 5′-TCCAGCGATCCTGGGTTCTA-3 ′; GAPDH, напред 5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 ′ и обратен 5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3 ′.

Имуноанализ, свързан с ензими (ELISA)

Концентрациите на IL-1β, IL-6, IL-8 и TNF-a се определят чрез търговски ензимно-свързан комплект за имуноанализ (ELISA, Sangon Biotech) съгласно процедурата, предоставена от производителя. Резултатите се изразяват в пикограми на милилитър. Активността на ензима на амилаза също се определя от наличен в търговската мрежа ензимно-свързан комплект за имуноанализ (кат. № K711-100, BioVision) съгласно процедурата, предоставена от производителя.

Оцветяване с пропидиум йод

Пропидиев йодид (PI) не може да проникне през непокътнати клетъчни мембрани, така че нормалните клетки или апоптотичните клетки с непокътнати клетъчни мембрани не могат да бъдат оцветени. Въпреки това, PI може да оцвети пироптотичните клетки, загубили целостта на клетъчните мембрани. Накратко, клетки AR42J се култивират върху покривни стъкла до прилепване и 80% сливане. Клетките се промиват в PBS и се фиксират в предварително охладен 70% етанол за 30 минути при 4 ° С и след това се обработват с 50 μL рибонуклеаза (100 μg/mL) в продължение на 20 минути. И накрая, 200 μL PI (крайна концентрация 50 μg/ml, Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай) бяха добавени, за да се инкубират в продължение на 30 минути на тъмно и след това се наблюдава PI оцветяване с флуоресцентен микроскоп и PI-положителните клетки бяха снимани и преброени.

Поточна цитометрия

Клетките AR42J бяха третирани с церулеин в продължение на 8 часа. Необработените клетки се използват като контрол. След интензивно измиване с PBS, съдържащ 2% (тегл./Об.) FBS, клетките се оцветяват с конюгирани с флуорохром антитела [анти-каспаза-1 (AG-20B-0042-C100) е от Adipogen; анти-каспаза-11 (NB120-10454) е от Novus] за FACS анализ. Цялата поточна цитометрия се извършва на поточен цитометър FACScalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) и данните се анализират от софтуера FlowJo 7.6.1.

Анализ на ген с двойна луцифераза

Дивият тип 3′UTR и мутантът 3′UTR на GSDMD са синтезирани от Sangon Biotech, използвайки Site-Directed Mutagenesis Kit (Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Шанхай, Китай) и вмъкнати в pGL3-LUC вектор на отчета (Промега). Проби от 2 × 10 5 AR42J клетки бяха засяти в 24-ямкови плаки за 12 часа и 100 ng празен вектор или GSDMD WT 3′UTR и MUT 3 ′ UTR вектори и 400 ng LUC репортерен вектор бяха ко-трансфектирани в клетки за 48 часа. След 48 часа трансфекция, клетките се събират и анализират за луциферазна активност, като се използва анализ на двойна луцифераза (Promega), съгласно инструкциите на производителя. Ко-трансфекцията с pRL-TK Renilla Luciferase Reporter Vector (Promega) беше използвана като контрола.

Анализ на Western Blot

Третираните клетки се лизират в RIPA буфер, съдържащ 1 mM DTT, 11 μg/ml DNase I и коктейл за инхибитор на протеаза (Roche) и се инкубират върху лед в продължение на 30 минути. Шестдесет микрограма протеинова проба се разделят чрез електрофореза върху денатуриран 10% SDS-PAGE гел и се попиват върху PVDF мембрана (Millipore). Първичните антитела (Anti-Caspase-1, 1: 1,000, ab138483, Abcam; Anti-цепнатия Caspase-1, 1: 1,000, ab207802, Abcam; Anti-Caspase-11, 1: 1,000, ab22684, Abcam Anti-цепнатия Caspase -11, 1: 1,000, ab180673, Abcam) се инкубират една нощ при 4 ° С. Заек моноклонален към GAPDH (EPR16891, Abcam) беше използван като контрола на натоварването. След това мембраните бяха изплакнати и впоследствие инкубирани с подходящи вторични антитела. Комплект ECL (Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай) е използван за откриване на лентите на Western blots.

CCK-8 Анализ на жизнеспособността на клетките

За тестове за жизнеспособност на клетките, трансфектираните клетки бяха засяти в 96-ямкови плаки (3000 клетки/гнездо) и клетъчната жизнеспособност беше оценена с помощта на CCK-8 комплект (Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай), съгласно инструкциите на производителя. Накратко, след трансфекцията, клетките бяха засяти в 96-ямкови плаки (3000 клетки/ямка) и култивирани в продължение на 24 часа. След това 10 μl разтвор на CCK-8 се добавят към средата за клетъчна култура и се инкубират за още 4 часа. Абсорбция при дължина на вълната 450 nm беше открита в четец на микроплаки (ELx808, BioTek, САЩ).

Статистически анализ

Всеки експеримент в това проучване се повтаря три пъти независимо. Данните са изразени като средно ± стандартно отклонение (SD). За анализ на данните е използван софтуерът SPSS Statistics 20.0 (IBM, Armonk, NY, USA). Дисперсионен анализ или двустранен студентски анализ т-тестът е използван за изчисляване на разликите между групите. P + PI + клетки в AR42J клетки след лечение с церулеин. Данните са представени като представителен график (горен) и количествено определени проценти (долен). (H) експресията на circHIPK3 се определя чрез qPCR в AR42J клетки след лечение с церулеин. *стр + пропидиев йодид (PI) + клетки, затворени върху AR42J клетки, третирани с церулеин в продължение на 8 часа в сравнение с контрола [(58,5 срещу 4,2%), Фигура 1G]. Освен това изследвахме нивото на експресия на circHIPK3 и забелязахме, че лечението с церулин значително увеличава експресията на circHIPK3 по начин, зависим от времето (Фигура 1Н). Тъй като увреждането на AR42J клетките, индуцирано от церулеин, е най-очевидно в 8-часовия момент, тази времева точка е избрана за следващи експерименти. Като цяло тези данни предполагат, че circHIPK3 и пироптозата са свързани с остър панкреатит.

Заглушаващ кръг Експресията на HIPK3 отслабва индуцираните от карулеин щети в AR42J клетки

За да изследваме ефекта на circHIPK3 върху AP, заглушихме circHIPK3 в AR42J клетки с лентивирус, пълен с интерференционни последователности и след това стимулирахме AR42J клетки с caerulein. трансфекцията с shRNA значително намалява нивото на circHIPK3 в сравнение с групата за скремблиране (Фигура 2А), но не променя експресията на гостоприемния ген HIPK3 (Фигура S1). Последвали експерименти показват, че заглушаването на circHIPK3 повишава жизнеспособността на клетките (Фигура 2В) и намалява броя на PI-позитивните клетки (Фигура 2С), потиска амилазната активност (Фигура 2D) и инхибира секрецията на възпалителните цитокини IL-1β, IL-6, IL-8 и TNF-a (Фигура 2Е). Освен това, заглушаването на circHIPK3 значително намалява експресията на разцепена каспаза-1 и каспаза-11. Тези резултати показват, че заглушаването на circHIPK3 значително отслабва индуцираното от церулеин увреждане в AR42J клетките и е свързано с пироптоза.

Фигура 2. circHIPK3 нокдаун инхибира медиираната от церулеин клетъчна смърт в AR42J клетките. (А) нивата на circHIPK3 бяха анализирани чрез qPCR след трансфекция на shRNA в AR42J клетки. (Б) Изследван е анализ CCK8 за измерване на клетъчната жизнеспособност в AR42J клетки след лечение с церулеин или с трансфекция на shRNA. (° С) Извършено е PI оцветяване за определяне на клетъчната пироптоза след лечение с церулеин или с трансфекция на shRNA в AR42J клетки. (Д) Амилазната активност се измерва с ELISA комплект след лечение с церулеин или с трансфекция на shRNA в AR42J клетки. (E) Нивата на възпалителни цитокини IL-1β, IL-6, IL-8 и TNF-a са измерени чрез ELISA комплекти в културална среда след лечение с церулеин или с трансфекция с shRNA. (F) Свързаните с пироптозата протеини каспаза 1 и каспаза 11 се анализират чрез имуноблот след лечение с церулеин или с трансфекция на shRNA в AR42J клетки (вляво) и лентите са количествено определени (вдясно). *стр Ключови думи: остър панкреатит, кръгова РНК, пироптоза, микроРНК, семейство газодермин

Цитиране: Wang J, Li X, Liu Y, Peng C, Zhu H, Tu G, Yu X и ​​Li Z (2020) CircHIPK3 насърчава пироптозата в ацинарните клетки чрез регулиране на оста miR-193a-5p/GSDMD. Отпред. Med. 7:88. doi: 10.3389/fmed.2020.00088

Получено: 28 ноември 2019 г .; Приет: 02 март 2020 г .;
Публикувано: 07 април 2020 г.

Клаус Т. Прайснер, Университет в Гисен, Германия

Xiaoguang Li, Johns Hopkins Medicine, САЩ
Zhengzhao Liu, Централен южен университет, Китай