Редактирано от Bert W. O’Malley, Медицински колеж Baylor, Хюстън, Тексас, и одобрено на 11 април 2018 г. (получено за преглед на 21 март 2018 г.)

errγ-hnf1β

Значимост

Бъбречните епителни клетки (REC) съдържат изобилие от митохондрии, които са от съществено значение за подпомагане на бъбречната реабсорбция на електролити, глюкоза и аминокиселини. Въпреки това остава слабо разбрано как митохондриалният метаболизъм се координира с реабсорбционните функции на бъбреците. Тук показваме, че делецията на свързана с естроген рецепторна гама (ERRy) в RECs води до тежка бъбречна митохондриална и реабсорбционна дисфункция с кисти, пълни с течност. ERRγ директно регулира митохондриалния метаболизъм и си сътрудничи при регулирането на гените за реабсорбция на бъбреците с чернодробен ядрен фактор 1 бета (HNF1β), чиито мутации причиняват поразително подобна бъбречна дисфункция и кисти при животни и хора. Тези открития разкриват ролята на ERRγ в едновременното координиране на транскрипционната програма на генериращите бъбречна енергия митохондриални и енергоемки реабсорбционни функции, свързани с бъбречно заболяване.

Резюме

Митохондриите са органели, които генерират по-голямата част от клетъчната енергия чрез окислително фосфорилиране (OxPhos) и окисляване на мастни киселини (FAO). Тяхната оптимална функция е от основно значение за здравето. Мутациите на митохондриалната ДНК и протеините директно причиняват митохондриална болест, като често се наблюдават тежки дефекти в органи с високо съдържание на митохондрии и енергийно търсене, включително бъбреците (1 ⇓ –3). Митохондриалната дисфункция като цяло е призната, че допринася в голяма степен за сърдечни заболявания, затлъстяване, диабет, невродегенерация, стареене и много бъбречни заболявания, включително остра бъбречна травма, поликистозна бъбречна болест и хронична бъбречна болест (ХБН) (1, 4 ⇓ ⇓ ⇓ - 8). ХБН се характеризира с постепенна загуба на бъбречна функция с различна етиология, не напълно разбрана патофизиология и липса на лечение. ХБН има както гломерулна, така и тубуларна клетъчна дисфункция, както и метаболитна дисрегулация (9). Транскриптомните и метаболомичните проучвания са свързани с нарушен митохондриален OxPhos при много бъбречни заболявания, включително ХБН (10, 11). Неотдавнашно проучване също така показва, че бъбречните митохондриални OxPhos и FAO са сред най-добрите нерегулирани клетъчни пътища както при пациенти с ХБН, така и при животински модели (12).

Сред всички бъбречни клетки, тубулите и събирателните канали бъбречните епителни клетки (RECs) имат много висока плътност на митохондриите. Основната физиологична функция на RECs е да поддържа хомеостаза на цялото тяло на осмолалност, киселинно-алкален баланс и обем на извънклетъчната течност чрез реабсорбция на вода, критични хранителни вещества и електролити. Механично тези реабсорбиращи функции се постигат чрез работата на много мембранни транспортери и канали, специфични за вода, глюкоза, аминокиселини, натрий, хлорид, бикарбонат и други биомолекули на REC апикални и базолатерални повърхности, като се използва клетъчен АТФ като краен енергиен източник . Съответно, REC са гъсто натъпкани с митохондрии и зависят от митохондриалните OxPhos и FAO, за да генерират енергия в подкрепа на техните реабсорбиращи функции. Въпреки това остава слабо разбрано как митохондриалният метаболизъм се координира с реабсорбиращите функции на бъбреците и как митохондриалната дисфункция допринася за бъбречно заболяване.

Неотдавнашната работа разкри гама на ядрения рецептор, свързан с естроген (ERRγ) като критичен транскрипционен регулатор на митохондриалните OxPhos и FAO (13 ⇓ –15). Проучвания, използващи специфични за клетъчния тип ERRγ KO мишки, заобикалят перинаталната леталност на ERRγ KO мишките на цялото тяло и предоставят категорични доказателства за съществена роля на ERRγ в невронния метаболизъм и обучение/памет, сърдечен метаболизъм и свиване/проводимост, функционално съзряване на панкреаса клетки, термогенна функция на кафявите адипоцити и определяне и функция на скелетните мускулни влакна (16 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –22). Геномните проучвания показват, че ERRy директно се свързва и активира транскрипцията на стотици гени, важни за митохондриалните OxPhos в невроните и OxPhos, FAO и гените за сърдечно свиване в сърдечните клетки (17, 23). В допълнение, ERRγ се изразява силно в бъбреците и е от съществено значение за нормалното ембрионално развитие на бъбреците (24). По-специално, генетичните проучвания при хора разкриват, че de novo реципрочна транслокация при t (1, 2) (q41; p25.3), включваща ERRγ локуса, е свързана с двустранна бъбречна агенезия/хипоплазия/дисплазия (25).

Тук генерирахме REC-ERRγ KO мишки и показваме, че те развиват бъбречна митохондриална и реабсорбционна дисфункция. Геномните проучвания показват, че ERRy регулира митохондриалния метаболизъм и бъбречната реабсорбция чрез различни механизми: въпреки че ERRy сам регулира митохондриалните функции OxPhos/FAO, ERRγ си сътрудничи с HNF1β, за да активира експресията на гени за реабсорбция на бъбреците. В допълнение, човешки пациенти с ХБН показват намалена бъбречна експресия на ERRy и споделят силно припокриващи се бъбречни транскрипционни сигнатури с REC-ERRγ KO мишки. Заедно тези резултати разкриват механизъм за координирана регулация на бъбречните митохондриални и реабсорбционни функции и идентифицират ERRγ сигнализирането като важна връзка към митохондриалната дисфункция, свързана с бъбречно заболяване.

Резултати

Загубата на ERRγ в RECs води до бъбречно заболяване с кисти.

Първо определихме къде ERRγ се експресира в постнаталните бъбреци, като анализираме ERRγ хетерозиготен щам на мишка, при който LacZ е ударен в ERRγ локуса (16). X-gal оцветяването разкрива, че ERRy е силно и специфично експресиран в RECs на всички сегменти на тубулите и събирателните канали, но едва откриваем в други клетки, включително тези в гломерулите (SI Приложение, Фиг. S1A). Освен това, ERRγ протеинът е открит изключително в ядрото, но не и в митохондриите или цитозола, в съответствие с неговата функция като ядрен транскрипционен фактор (SI приложение, фиг. S1B).

За да определим значението на ERRy в постнаталната биология на бъбреците и заболяванията, генерирахме REC-ERRγ KO мишки чрез кръстосване на мишки, приютяващи флоксиран алел на ERRγ (17) със щам Sim1-Cre. Силна бъбречна експресия на Cre се е появила при раждането и е довела до бърза постнатална загуба на експресия на ERRy в бъбреците само с 15% ERRy mRNA, останала до 1 седмица на възраст (приложение SI, фиг. S1C). Използвайки двоен флуоресцентен щам на мишка Cre reporter (26), по-нататък установихме, че тази линия Sim1-Cre медиира рекомбинация, специално във всички сегменти на тубула и събиране на епител на канал в бъбреците (SI Приложение, Фиг. S1D), точно където е ERRγ нормално изразени (приложение SI, фиг. S1A). Използвахме както мъжки, така и женски мишки REC-ERRγ KO за всички следващи проучвания.

Както мъжките, така и женските REC-ERRγ KO мишки (Cre +) са родени и са оцелели перинатално при очакваното съотношение на Мендел. Бъбреците им са с нормално тегло и хистологичен вид при раждането и на 3 седмици, което предполага, че няма дефекти в развитието (фиг. 1 A – C). В съответствие с хистологичните наблюдения, електронната микроскопия показва, че бъбречната ултраструктура, включително митохондриите в гломерулите, проксималните тубули и дисталните тубули, е сравнима с контролите на възраст 3 седмици (SI Приложение, Фиг. S2). Впоследствие обаче, както при мъжете, така и при жените REC-ERRγ KO мишките се развиват прогресивни бъбречни аномалии (фиг. 1А). Бъбреците на REC-ERRy KO мишките са били значително по-тежки от контролите на 1 месец възраст и три пъти по-тежки на възраст от 3 месеца (Фиг. 1 В и D). Хистологичното изследване показа, че REC-ERRy KO бъбреците на мишки съдържат множество кисти, пълни с течност с променливи размери (фиг. 1Е), което води до нарушаване на цялостната бъбречна организация и структура. Гломерулите присъстваха и изглеждаха хистологично нормални въз основа на H&E оцветяване. Богатите на въглехидрати базални мембрани на гломерулите, включително капилярни бримки, отговорни за бъбречната филтрационна функция, също остават непокътнати, както е оценено чрез периодично оцветяване с киселина и Шиф (Фиг. 1Е). Тези открития предполагат, че ERRy е от решаващо значение за поддържане на нормална бъбречна структура и функция in vivo.

REC-ERRγ KO мишките развиват бъбречно заболяване с кисти, пълни с течност. (A и B) Представителни снимки (A) и тегло (B) на контролни и REC-ERRγ KO бъбреци на различни възрасти (n = 12–19). (C) Триседмичен контрол и морфология на бъбреците REC-ERRγ KO. (Отгоре) H&E петно. (Мащабна лента, 1000 µm.) (Средно) H&E оцветяване. (Мащабна лента, 100 µm.) (Отдолу) Периодична киселина-Шиф петно ​​(Мащабна лента, 100 µm.) Стрелките сочат към гломерулите. (D) Бъбреци (червени стрелки) на 3-месечни контролни и REC-ERRγ KO мишки, илюстриращи относителните им размери спрямо тялото. (E) Тримесечен контрол и морфология на бъбреците REC-ERRγ KO. Лентите за оцветяване и скала са същите като в C. Лентата за грешка показва SEM. * P - и Cre + чрез t тест. Включени са както мъжки, така и женски мишки.

ERRγ директно регулира митохондриалната метаболитна и бъбречна реабсорбционна функция.

ERRγ е от съществено значение за поддържане на нормална експресия на REC митохондриални метаболитни и бъбречни реабсорбиращи гени. (A) Вулканичен парцел, показващ гени, диференцирано експресирани в 3-седмичен стар контрол и REC-ERRγ KO бъбреци от RNA-Seq (n = 4). Критериите за филтриране са промяна в пъти> ± 1,5 и P - и Cre + чрез t тест. Включени са както мъжки, така и женски мишки.

След това изследваме дали промените в бъбречната транскриптома при REC-ERRγ KO мишки зависят от пола. Както мъжките, така и женските REC-ERRy KO мишки показват сходни промени в пътя както за надолу, така и за регулирани нагоре гени (SI Приложение, Фиг. S3B). Това е в съответствие с факта, че и двата пола на REC-ERRγ KO мишки развиват бъбречно заболяване. За да определим дали тези молекулярни дефекти на митохондриалните и бъбречните функции се запазват в по-късния стадий на бъбречно заболяване, направихме анализ на RNA-Seq при 3-месечни мъжки контролни и REC-ERRγ KO мишки и го сравнихме с RNA-Seq данни от 3 -wk-стари мъжки мишки. Всички надолу регулирани и повечето от регулираните нагоре клетъчни пътища се поддържат в 3-месечни REC-ERRγ KO мишки (SI Приложение, Фиг. S3C). Няколко допълнителни регулирани нагоре клетъчни пътища бяха открити на възраст от 3 месеца, вероятно отразяващи вторични промени в по-късния етап на бъбречно заболяване.

След това изследвахме дали митохондриалният метаболизъм и бъбречната функция на реабсорбция са били нарушени при REC-ERRγ KO мишки. Установено е, че ензимните активности на множество митохондриални електронно-транспортни верижни комплекси намаляват в 3-wk-стари бъбреци REC-ERRγ KO (Фиг. 3А), в съответствие с тяхната намалена експресия на РНК. В допълнение, съдържанието на mtDNA е значително намалено (Фиг. 3В), въпреки нормалните митохондриални ултраструктури, което показва митохондриална дисфункция. Важно е, че всички тези митохондриални метаболитни дефекти са налице на 3 седмици, преди да се наблюдават някакви морфологични или функционални бъбречни дефекти, което предполага, че митохондриалната дисфункция е генеза за бъбречни дефекти при REC-ERRγ KO мишки.

ERRγ си сътрудничи с HNF1β за регулиране на транскрипцията на бъбречни реабсорбиращи гени. (A) Топ 5 de novo мотиви близо до ERRγ ChIP-Seq върхове. (B) Припокриване на бъбречни пикове ERRy и HNF1β ChIP-Seq. Оста е log2 тагове/10 7 четения. (C) Топ 10 пътища на гени, анотирани към пикове ERRγ и/или HNF1β ChIP-Seq. (D) Представителни пикове на ERRγ и HNF1β ChIP-Seq. оста y е четене на пик. Същата скала за контролни и ERRγ KO RNA-Seq следи. (E) Свързване на ERRy и/или HNF1β близо до OxPhos, FAO и гени за реабсорбция на бъбреците чрез ChIP.

ERRγ и HNF1β функционално си сътрудничат, за да регулират гените на реабсорбция на бъбреците.

Функционално сътрудничество между ERRγ и HNF1β при регулиране на бъбречната функция. (A) HNF1β ChIP-ERRγ reChIP-Seq и анализ на данни. (B) Atp1b1 се свързва чрез ERRy и HNF1β в същите клетки чрез ChIP-reChIP-qPCR. (C) Подобрено активиране на експресията на Atp1b1 както от ERRγ, така и от HNF1β.

След това изследвахме дали ERRγ и HNF1β функционално си сътрудничат, за да регулират транскрипцията на гени за реабсорбция на бъбреците. Не успяхме да открием физическо взаимодействие между ERRy и HNF1β в лизати от бъбречни клетки или бъбреци на мишки, използвайки коимунопреципитация, последвано от Western blot (SI Приложение, Фиг. S5D). Това предполага, че те или не си взаимодействат директно, или тяхното взаимодействие не е достатъчно силно, за да бъде открито по този метод, както беше съобщено по-рано в случаите на транскрипционен фактор (36). Експресията на ERRy и HNF1β свързани гени като Atp1b1 се активира или от ERRy, или от HNF1β, и допълнително се увеличава както с ERRy, така и с HNF1β (фиг. 5С). Заедно тези резултати предполагат, че ERRγ и HNF1β функционално си сътрудничат за регулиране на гените за реабсорбция на бъбреците.

Човешки пациенти с ХБН показват намалена бъбречна ERRγ експресия и споделят силно припокриващи се бъбречни транскрипционни подписи с REC-ERRγ KO мишки.

За да свържем тези констатации за ERRy с бъбречни заболявания при хора извън вродените разстройства (25), ние измерихме експресията на бъбречната ERRγ в 95 проби от човешки бъбречни тубули от пациенти с ХБН и контролни кохорти. Установихме, че експресията на ERRy положително корелира със скоростта на гломерулна филтрация (GFR), добре установен клиничен индекс за бъбречната функция (фиг. 6А). В допълнение, бъбречната експресия на ERRy е значително намалена при пациенти с ХБН (GFR 60; Фиг. 6В). След това сравнихме бъбречните транскриптоми между мишки REC-ERRγ KO и пациенти с ХБН (12). Около 25% от регулираните надолу и 19% от регулираните нагоре гени в REC-ERRγ KO мишки са били споделени при хора с ХБН (фиг. 6 С и D). Съществува значително припокриване на засегнатите пътища между мишки REC-ERRγ KO и пациенти с ХБН. По-специално, пътищата, регулирани надолу, са почти идентични при мишки и хора и включват много митохондриална функция и пътища за реабсорбция на бъбреците, които се регулират от ERRγ. Тези резултати предполагат широка и критична роля за ERRy при бъбречно заболяване при човека.

Човешки пациенти с ХБН показват намалена бъбречна експресия на ERRy и споделят силно припокриващи се бъбречни транскрипционни сигнатури с REC-ERRγ KO мишки. (A) Експресията на ERRy положително корелира с GFR в 95 проби от човешки бъбречни тубули, чрез корелация на Pearson. (B) Експресията на ERRy е значително намалена при човешки бъбречни тубули с ХБН, чрез t тест. (C и D) Сравнение на диаграмата на Venn и топлинната карта на обогатените отгоре пътища на бъбречни гени, регулирани надолу (C) или регулирани нагоре (D), между 3-седмични REC-ERRγ KO мишки и пациенти с ХБН. Статистическият анализ беше извършен с помощта на точния тест на Fisher. (E) Модел, илюстриращ, че ERRγ координира генериращ енергия митохондриален метаболизъм и енергоемки бъбречни функции на реабсорбция чрез различни механизми.

Дискусия

Материали и методи

Всички проучвания с мишки са одобрени и извършени съгласно указанията на Институционалния комитет за грижа и употреба на животните към Детската болница във Филаделфия. Аденовирусите се генерират, както е описано по-рано (39, 40). Трансмисионна електронна микроскопия, генна експресия, Western blot, измерване на клетъчна консумация на кислород, митохондриална ДНК и анализ на ензимната активност бяха извършени, както е описано по-рано (18, 41). Моля, вижте приложението SI, SI материали и методи за подробно описание на проучвания върху мишки, клетъчна култура, усвояване на глюкоза, хистологичен анализ, експерименти с RNA-Seq, ChIP-Seq и ChIP-reChIP-Seq. Статистическият анализ беше извършен с помощта на тест на Student, корелация на Пиърсън или точен тест на Fisher. Данните от микрочипове са депозирани в базата данни ArrayExpress (E-MTAB-2502). Данните за RNA-Seq, ChIP-Seq и ChIP-reChIP-Seq са депозирани в базата данни GEO (GSE104907).

Благодарности

Благодарим на д-р Дъглас Уолъс, д-р Мичъл Лазар, д-р Матю Вайцман, д-р Амита Сехгал, д-р Майкъл Маркс и д-р Марк Кан за критичното обсъждане на проекта. Благодарим на д-р Biao Zuo, д-р Ray Meade и централното съоръжение на UPenn Electron Microscopy Laboratory за техническа поддръжка. Авторите и тази работа бяха подкрепени от Службата на помощник-министъра на отбраната по здравни въпроси чрез Програма за медицински изследвания с партньорска оценка под награда W81XWH-16-1-0400 и пилотни награди от Центъра за изследване на диабета в Университета на Пенсилвания от безвъзмездна помощ, спонсорирана от NIH (DK19525; DK111495 за LP; DK099379 за BJW; DK108987 за GDB; и DK087635 и DP3 DK108220 за KS).

Бележки под линия

  • ↵ 1 До кого трябва да се адресира кореспонденция. Имейл: lpeipennmedicine.upenn.edu .