Мариана Шрьодер

1 Катедра по невробиология, Научен институт Weizmann, Rehovot, 76100, Израел

2 Катедра по стресова невробиология и неврогенетика, Институт по психиатрия Макс-Планк, Мюнхен, 80804, Германия

Йонат Дрори

1 Катедра по невробиология, Научен институт Weizmann, Rehovot, 76100, Израел

2 Катедра по стресова невробиология и неврогенетика, Институт по психиатрия Макс-Планк, Мюнхен, 80804, Германия

Yair J. Ben-Efraim

1 Катедра по невробиология, Научен институт Weizmann, Rehovot, 76100, Израел

2 Катедра по стресова невробиология и неврогенетика, Институт по психиатрия Макс-Планк, Мюнхен, 80804, Германия

Алон Чен

1 Катедра по невробиология, Научен институт Weizmann, Rehovot, 76100, Израел

2 Катедра по стресова невробиология и неврогенетика, Институт по психиатрия Макс-Планк, Мюнхен, 80804, Германия

Свързани данни

Резюме

Консумацията на нискокалорична диета е най-често срещаният подход за отслабване. Макар като цяло да е ефективен в началото, той често е последван от рецидив, при който теглото преди диетата се възвръща и често надвишава. Този модел на повтаряща се загуба/възстановяване на теглото се нарича циклиране на теглото и резултатният метаболитен отговор варира значително при отделните индивиди.

Обективен

Опитахме се да разгледаме въпроса за индивидуалните различия в отговора на циклирането при тегло при мъжки мишки.

Методи

Първо изложихме възрастни мишки от див тип на повтарящи се цикли храна с високо/ниско съдържание на мазнини. След това, използвайки лентивирусен подход, ние съборихме или свръхекспресирахме miR-219 във вентромедиалния хипоталамус (VMH) на допълнителна мишка кохорта и извършихме пълна метаболитна оценка.

Резултати

Излагането на мъже от див тип на колоездене води до разделяне на кохортата на подгрупи от резистентни спрямо предразположени към метаболитен синдром животни (МС) животни, които се различават в техния метаболитен профил и нивата на хироталамусния miR-219. Лентивирусният нокдаун на miR-219 във VMH доведе до обостряне на метаболитния синдром. За разлика от това, свръхекспресията на miR-219 води до умерено намаляване на фенотипа на метаболитния синдром.

Заключения

Нашите резултати предполагат роля на miR-219 в медиацията на метаболитния фенотип в резултат на многократно циклиране на теглото.

1. Въведение

Хипоталамусът, и особено средно-базалният хипоталамус, е ключовият мозъчен регион, който интегрира периферни и централни сигнали, предаващи информация за хранителното състояние и променящите се енергийни нужди, като по този начин поддържа постоянна енергийна хомеостаза. Вентромедиалният хипоталамус (VMH) съдържа неврони, които директно реагират на глюкозата и участват в метаболизма на чернодробната глюкоза чрез еферентни влакна на симпатиковата нервна система, които достигат до черния дроб чрез спланхничния нерв [7]. Ново, допълнително ниво на сложност към механизма на метаболитния баланс се появи с новооткритите хипоталамусни малки некодиращи РНК (miRNAs), участващи в регулирането на енергийната хомеостаза, включително процеси, свързани с метаболизма, като инсулинова секреция, глюкозен и липиден метаболизъм (прегледани в [8]) и метаболитен отговор на хранене с високо съдържание на мазнини (HFD) или ограничаване на калориите [9].

В настоящото проучване ние изследвахме индивидуалните разлики в метаболитния профил на мишки, подложени на повтарящо се метаболитно предизвикателство успоредно на отпечатъка на хипоталамусния miRNA с цел изследване на централните молекулярни механизми, отговорни за индивидуалните различия в метаболитния отговор на WC. Съобщаваме, че повтарящи се селективно индуцирани наддаване на тегло, непоносимост към глюкоза, инсулинова резистентност и хипер-затлъстяване при подгрупа мишки по начин, подобен на хроничната експозиция на HFD, но не са имали дълготрайни ефекти върху по-нататъшна подгрупа от генетично идентични животни . Нашите резултати показват, че miR-219 във VMH играе централна роля в посредничеството на енергийната хомеостаза. Открихме, че чрез събаряне на miR-219 във VMH, предразположението към метаболитно заболяване се е увеличило значително. За разлика от това, когато е свръхекспресиран, miR-219 във VHM умерено защитава животните от този фенотип. Следователно сме изложили потенциален миРНК-медииран хипоталамусен механизъм, участващ в справянето с WC, който води до чувствителност или резистентност към метаболитно заболяване.

2. Материали и методи

2.1. Животни

Мъжки мишки C57BL/6J (IMSR_JAX: 000664) и бременни женски ICR мишки и техните малки (IMSR_JAX: 009122) се поддържат в мишка, контролирана без патогени (22 ± 1 ° C), на 12 часа светлина/тъмно цикъл в Научния институт Вайцман, съгласно институционалните насоки. Храната и водата се дават ad libitum.

2.2. Модел за колоездене с тежести

За да се установи модел на повтарящо се наддаване и загуба на тегло, 9-седмични мъжки мишки C57BL/6J (n = 60) са били хранени ad libitum HFD (60% от калориите) (D12492 Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, САЩ) в продължение на 3 седмици, последвани от 2 седмици редовна чау диета ad libitum (Harlan Biotech Israel Ltd, Rehovot, Израел). Тази процедура се повтаря 3 последователни пъти (общо 15 седмици). Мишките се претеглят два пъти седмично. Този период на колоездене е избран след предварителен експеримент, показващ, че промяната в наддаването на тегло след 3 седмици HFD и 2 седмици редовно чау е сравнително умерена. Следвайки протокола за WC, метаболитният фенотип на мишките беше оценен чрез определяне на хомеостазата на глюкозата в цялото тяло, индиректната калориметрия и телесния състав.

2.3. Тестове за глюкоза и инсулинов толеранс

Глюкоза (2 g/kg телесно тегло) се инжектира i.p. след 6,5 часа на гладно. Цялата венозна кръв, получена от опашната вена на 0, 15, 30, 60, 90 и 120 минути след инжектирането, беше измерена за глюкоза с помощта на автоматичен глюкомер (Roche). За теста за инсулинов толеранс мишките се инжектират с инсулин (0,75 или 1 единици/кг телесно тегло) след 4-5 часа на гладно. Нивата на кръвната глюкоза са измерени 0, 15, 30, 60 и 90 минути след инжектиране на инсулин.

2.4. Състав на тялото

Съставът на тялото беше оценен с помощта на EchoMRI-100 ™ (Echo Medical Systems, Хюстън, Тексас, САЩ).

2.5. Метаболитни изследвания

Непряката калориметрия, приемът на храна и вода, както и двигателната активност бяха измерени с помощта на системата LabMaster (TSE-Systems, Бад Хомбург, Германия). Инструментът LabMaster се състои от комбинация от сензори за хранене и пиене за автоматизирано онлайн измерване. Калориметричната система е система с отворен кръг, която определя консумацията на O2, производството на CO2 и съотношението на дихателния обмен. Базираната на фотолъч система за наблюдение на активността открива и записва амбулаторни движения, включително отглеждане и катерене, във всяка клетка. Всички параметри се измерват непрекъснато и едновременно. Данните бяха събрани след 24-часов адаптационен период в климатизиран единичен корпус.

2.6. Хипоталамусна екстракция на иРНК и профил на експресия на миРНК

В крайната точка на експеримента с WC се събират пресни хипоталами и се замразяват върху сух лед. Общата mRNA беше изолирана с помощта на miRNeasy mini kit (QIAGEN, Hilden, Германия) и комерсиално профилирана с nCounter miRNA Expression Assay (Nanostring Technologies, Seattle, WA). Суровите данни бяха нормализирани до положителни контролни стойности и до 100-те най-често експресирани miRNAs и коригирани за фонови корекции с помощта на nCounter Data Analysis.

2.7. Клониране на 3 ′ UTRs в експресионен плазмид на луцифераза Psicheck2

3'UTR последователността на Cnrip1 беше PCR амплифицирана от геномна ДНК на мишка, използвайки следните праймери: 5'-ATGATTCCTTCTGATGTTGC-3 'и 5'-ATTACCATTCCATACACGGT-3'. След това 3′UTR фрагментът се лигира в pGem-T лесен вектор (Promega, Madison, WI) съгласно указанията на производителя и 15 допълнително се субклонира в един сайт NotI в 3 ′ края на луциферазата в репортерния плазмид Psicheck2 (Promega, Мадисън, Уисконсин). Ориентацията на клонирането беше проверена чрез диагностични разрязвания и последователност. Мутирала форма на Cnrip1 3′UTR, в която липсват всичките 6 основи на miR-219 запазена последователност на съвпадение на семена, беше установена чрез генериране на 2 частично комплементарни PCR фрагмента, използвани като шаблони за лигиране на PCR (праймери: 5′-CTGATGTTGCAACTCCAGAAA-3 ′ и 5 ′ -CAGTTTCTGGAGTTGCAACAT-3 ′, всеки използван с 1 от гореспоменатите праймери). 3′UTR последователностите на Cc2d1a и Rbms1 бяха субклонирани, както е описано по-горе, като се използват следните праймери - Cc2d1a 3′UTR: 5′-CCCATCCTGGACTACAGGC-3 ′ и 5′-GCCTTGGCTGTTCATTCTGT-3 ′; Cc2d1a мутира 3 ′ UTR: 5′-CAACTGTCCGCTGCTTGTCTGTT-3 ′ и 5′-ACAGACAAGCAGCGGACAGTTGG-3 ′; Rbms1 3′UTR: 5′-CTGTGAGATGTACCGAAGGG-3 ′ и 5′-TGTTAGTGTACAGCCTTATAAACA-3 ′; Rbms1 мутира 3'UTR: 5′-GAAGGCTGATGGATTTTTC-3 ′ и 5′-AAAATCCATCAGCCTTCAC-3 ′.

2.8. Трансфекции и анализ на луцифераза

Huh7 клетки се отглеждат на покрити с поли-лизин 48-ямкови плаки до 70–85% сливане и се трансфектират с помощта на jetPEI (Polyplus-transfection SA, Illkirch, Франция) в съответствие с инструкциите на производителя със следните плазмиди: 5 ng Psicheck2 -3 ′ UTR плазмид и 215 ng засилен зелен флуоресцентен протеин (EGFP) свръхекспресиращ вектор или за miR-219, или за разбъркан miR EGFP плазмид. Четиридесет и осем часа след трансфекцията, клетките бяха лизирани и луциферазната репортерна активност беше изследвана, както беше описано по-горе [10]. Стойностите на ренила луцифераза се нормализират чрез контролни нива на луцифераза (транскрибират се от същия вектор, но не се влияят от тествания 3 ′ UTR) и се осредняват при 8 повторения на кладенци за условие.

2.9. Проектиране, конструиране и валидиране на miR-219 лентивируси

2.10. Стереотаксични интракраниални инжекции

Лентивирусите се инжектират с помощта на компютърно ръководен стереотаксичен инструмент и моторизиран наноинжектор (Angle Two Stereotaxic Instrument, myNeurolab, Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). Мишките бяха анестезирани с 1,5% изофлуран и 1 μl от лентивирусния препарат беше доставен на всеки VMH с помощта на спринцовка Hamilton, свързана към моторизирана система за наноинжектори със скорост от 0,15 μl в минута (координати спрямо брегма: AP = -1,46 mm, ML = ± 0,3 mm, DV = -5,5 mm). Мишките бяха подложени на WC протокола 1 седмица след инжектирането.

2.11. In situ хибридизация за откриване на miR-219

Парафиновите срезове на възрастни мозъци C57BL/6 (-1,58 mm от брегма) бяха хибридизирани с маркирани с DIG сонди с заключена нуклеинова киселина (LNA) (Exiqon, Vedbaek, Дания) през нощта при 55 ° C (U6 и miR-219) и 60 ° C (miR-124), както е описано по-рано в [13] и разработен с нитросиня тетразолиев хлорид/5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (NBT/BCIP) среда.

2.12. PCR анализ в реално време

Количествената експресия на следните гени беше получена и анализирана с помощта на термоциклер от стъпка 1 (Applied Biosystems, Waltham, MA), като бяха използвани праймери, които са създадени специално за тях.

MiR-219-5p: 5′- TGATTGTCCAAACGCAATTCT - 3 ′.

Cnrip1: 5′ - TAAAGAGCCTGACGGGGAGA - 3 ′ и 5′ - CCACACTGTCTCGAAGGTCC - 3 ′

Cc2d1a: 5′- ACCCTCTACCAGTCTGCACT - 3 ′ и 5′- AGCAGGTTTTCCAGCGTCTT - 3 ′

Htr1a: 5′- GTGCACCATCAGCAAGGACC - 3 ′ и 5′- GCGCCGAAAGTGGAGTAGAT - 3 ′

Rbms1: 5′- TACGTGATTCCAGTGGTGCC - 3 ′ и 5′- ACTCCTGGTGGGGTCTTGAT - 3 ′

Сарколипин: 5′- TGTGCCCCTGCTCCTCTTC - 3 ′ и 5′- TGATTGCACACCAAGGCTTG - 3 ′

Пробите от РНК бяха оценени с помощта на комплект за обратна транскрипция на miScript и комплект за PCR SYBRGreen (QIAGEN, Hilden, Германия), съгласно указанията на производителя. U6 snRNA беше използвана като вътрешен контрол.

2.13. Western blot анализ

Хипоталами от отделен набор от WC животни се хомогенизират в RIPA буфер и се инкубират върху лед в продължение на 10 минути. Хомогенатът се центрофугира в продължение на 15 минути и супернатантата се прехвърля в нова епруветка и пробите се добавят с пробен буфер и се варят в продължение на 5 минути. Пробите се разделят върху 12% акриламиден гел SDS PAGE и се прехвърлят в нитроцелулозна мембрана. След блокиране с 10% мляко, αCnrip1 (заешки поликлонален анти-CNRIP1, AB_10709018), αCc2d1a (заешки моноклонален анти-Cc2d1a ab191472, abcam, Кеймбридж, Великобритания) и αActin (миши моноклонален антиактин, Cell Signaling Technology, Beverly, MA ) бяха добавени за една нощ при 4 ° С. Вторични антитела се добавят при стайна температура в продължение на 2 часа (HRP срещу заек и HRP срещу мишка, Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Накрая, ECL беше добавен към мембраната, която беше изложена на филм.

2.14. Статистически подход

Разпределението на всяко WC животно в устойчивите, умерени и склонни към МС подгрупи беше определено чрез йерархичен клъстер анализ, използващ метода на Уорд и на квадрат евклидово разстояние. Силата на предикторите се определя чрез двустепенно групиране. Различните параметри на MS бяха анализирани с помощта на параметрични тестове, T-тестове, ANOVA и повторни измервания ANOVA, когато е уместно. За сравнение между експериментите WC, KD и OE, Z резултатите от инжектираните групи за лечение (miR-219 KD/OE) първо се нормализират към контролите за скремблиране във всеки експеримент и след това всеки резултат се умножава по оценката на предикторите в експериментът за WC. За да получат статистическа мощ и да визуализират ефекта, който манипулациите с miRNA оказаха върху техните глобални резултати, групите за скремблиране бяха разделени на две нови подгрупи. Тези с положителни Z оценки бяха определени като склонни към МС, а тези с отрицателни резултати бяха определени като устойчиви. След това глобалните резултати на miR-219 KD и miR-219 OE и средните необработени данни бяха сравнени с различните подгрупи за бъркане, за да се получи оценка на тяхното положение в спектъра на реакция. Всички данни бяха анализирани с помощта на IBM SPSS версия 20 и Graphpad Prism5.

3. Резултати

регулира

4. Дискусия

Появата на MiRNAs като важни регулатори на енергийната хомеостаза, включително секреция на инсулин, метаболизъм на глюкоза и липиди [8] е показана в редица скорошни проучвания. Някои примери включват miR-200a, miR-200b и miR-429, които бяха регулирани нагоре в хипоталамуса на лептинови дефицитни ob/ob мишки и регулирани надолу в отговор на лечение с лептин [26]. В това проучване хипоталамусното заглушаване на miR-200a повишава нивата на експресия на лептиновия рецептор и инсулиновия рецепторен субстрат 2, намалява наддаването на телесно тегло на мишките и възстановява реакцията на черния инсулин. По-нататъшно проучване показа регулиране на miR-383, miR-384-3p и miR-488 в хипоталамуса на ob/ob мишки [27]. И накрая, инфузия на олигонуклеотиди, имитиращи 10 специфични miRNAs, за които се прогнозира, че са насочени към PI3K-Akt-mTOR пътя към дъгообразното ядро ​​на хипоталамусната атенюирана затлъстяване в Dicer KO [28], допълнително предполагайки miRNAs в регулирането на енергийния баланс.

Втората ни цел, Cc2d1a (известен също като Freud-1) е транскрипционен репресор за серотониновия рецептор (Htr) 1a, чрез свързване с 5'-репресорен елемент (FRE) на гена Htr1a [38]. Протеинът CC2D1a е локализиран съвместно с рецептора Htr1a in vivo, което предполага неговото значение за регулирането на рецептора [39]. Като се имат предвид дълбоките ефекти на серотонергичната невротрансмисия върху поведението на хранене, което се медиира предимно чрез рецептори Htr1a и Htr2c [40], [41], [42], потискането на Htr1a от Cc2d1a може да регулира поведението на хранене в отговор на WC. Htr1a се експресира във VMH сред другите области в хипоталамуса [40] и следователно е вероятна непряка цел на miR-219 чрез регулиране на Cc2d1a. И накрая, потенциалното взаимодействие между серотонина и канабиноидната система чрез Htr1a и CB1 рецепторите [43], [44] може да добави допълнителен слой на сложност към регулирането на метаболитния отговор на WC в резултат на регулиране нагоре/надолу на miR -219 във VMH.

5. Заключения

Като цяло ние идентифицирахме специфичен хипоталамусен механизъм, чрез който miR-219 медиира метаболитния отговор на WC. Ендогенната вариация на тази miRNA във VMH изглежда определя голямата вариабилност, наблюдавана в отговор на метаболитно предизвикателство сред генетично идентични индивиди. Това води до успешно или дефектно справяне с WC, което води до развитието на МС. Чрез насочване към Cnrip1 и Cc2d1a, ние предлагаме miR-219 като механистичен път в основата на индивидуалния отговор на WC.