Резюме

Предистория и цели

Предишни проучвания показват, че хранителният статус може да промени лекарствения метаболизъм, което може да доведе до неуспех на лечението или нежелани странични ефекти. Това проучване оценява ефекта от две хранителни състояния, краткосрочно гладуване и краткосрочна диета с високо съдържание на мазнини (HFD) върху цитохром P450 3A4 (CYP3A4) и уридин 5′-дифосфо-глюкуронозилтрансфераза (UGT) медииран метаболизъм чрез изучаване на фармакокинетика на мидазолам и неговите основни метаболити.

хранителният

Методи

В рандомизирано контролирано кръстосано проучване, девет здрави субекта са получили еднократно интравенозно приложение на 0,015 mg/kg мидазолам след: (1) бързо през нощта (контрол); (2) 36 часа на гладно; и (3) пост през нощта след 3 дни HFD, състоящ се от 500 ml сметана, допълнена към обичайната им диета. Фармакокинетичните параметри бяха анализирани едновременно, като се използва нелинейно моделиране на смесени ефекти.

Резултати

Краткосрочното гладуване повишава CYP3A4-медиирания клирънс на мидазолам с 12% (стр Ключови точки на FormalPara

Гладуването диференцирано променя метаболизма на мидазолам чрез увеличаване на метаболизма, медииран от CYP3A4, но чрез намаляване на метаболизма, медииран от UGT.
Краткосрочният HFD не повлиява фаза I (CYP) или фаза II (UGT) медииран метаболизъм на мидазолам.

Въведение

Пациентите реагират по различен начин на лекарствената терапия. Това често се дължи на разликите в метаболизма на лекарството и може да доведе до неуспех на лечението, повишени странични ефекти или дори токсичност. Факторите, които допринасят за тази променливост в метаболизма на лекарствата, включват генетични, физиологични, фармакологични, фактори на околната среда и хранителен статус, като гладно или диета с високо съдържание на мазнини (HFD) [1].

Предишните проучвания върху животни и хора показват, че хранителният статус може да промени лекарствения метаболизъм, като повлиява ензимната активност на цитохром Р450 (CYP) [2,3,4,5,6,7]. Освен това, хранителният статус може също да повлияе на ензимната активност на уридин 5'-дифосфо-глюкуронозилтрансфераза (UGT). Например, експресията на UGT в черен дроб на мишка се увеличава при затлъстяване и индуцирана на гладно стеатоза [8]. Наскоро демонстрирахме, че краткосрочното гладуване модулира CYP-ензимната активност по неравномерен модел чрез увеличаване на системния клирънс на CYP1A2 сондата кофеин и CYP2D6 сондата метопролол и чрез намаляване на системния клирънс на С-варфарин, който е сонда за CYP изоформа CYP2C9 [6, 9].

CYP и UGT ензимната активност също могат да бъдат модулирани чрез HFD. Проучванията при животни разкриват диференциални ефекти на хиперкалоричната HFD върху CYP и UGT ензимите [8, 10,11,12]. Освен това, Miyauchi et al. наскоро показаха разлики в нивата на експресия на протеини както на CYP ензимите, така и на UGT ензимите при пациенти със затлъстяване [13]. В допълнение, ние показахме, че краткосрочният хиперкалоричен HFD при хората увеличава излагането на перорално приложен мидазолам и омепразол, които са сонди за CYP3A4 и CYP2C19, съответно [7].

Мидазолам се метаболизира основно (≈ 95%) от CYP3A4 до 1-OH-мидазолам, което прави лекарството подходяща сонда за изоформа CYP3A4 [14, 15]. Малка част се метаболизира до 4-OH-мидазолам и до 1,4-OH-мидазолам, но тъй като процентът на тези метаболити, екскретирани в урината, е по-малък от 4%, тези пътища на елиминиране на мидазолам не се считат за значими [14, 15 ].

След окислително хидроксилиране метаболитите 1-OH-мидазолам и 4-OH-мидазолам се глюкуронират чрез UGT (фаза II на метаболизма на лекарството), за да се даде възможност за екскреция с урината [14]. Zhu et al. идентифицира О-свързани и an н-свързан глюкурониден конюгат на 1-OH-мидазолам, чието образуване се катализира от различни UGT изоформи [16]. The О-глюкуронидът се катализира от UGT2B4/2B7, докато н-глюкуронидът се катализира от UGT1A4 [16]. Тъй като максималният вътрешен просвет за О-глюкуронирането беше

9 пъти по-висока от тази за н-глюкурониране, медиираното от CYP3A4 хидроксилиране на мидазолам до 1-OH-мидазолам, последвано от UGT2B4/2B7-медиирано глюкурониране до 1-OH-мидазолам-О-глюкуронидът представлява основният път на метаболизма на мидазолам [16]. Чрез изучаване на фармакокинетиката на изходното съединение заедно с основните му метаболити, 1-OH-мидазолам и 1-OH-мидазолам-О-глюкуронид, мидазолам може да служи не само като сонда за CYP3A4 ензимна активност, но също така и за UGT (UGT1A4, UGT2B4/2B7) ензимна активност.

В предишните ни проучвания, проведени върху ефекта на краткосрочното гладуване и краткосрочната HFD, ние се фокусирахме върху изходното съединение мидазолам и демонстрирахме, че краткосрочното гладуване не влияе върху системния клирънс или бионаличността на лекарството [6, 9]. Утвърденият аналитичен метод, използван в предишните ни докладвани проучвания, не включва анализ на метаболити на мидазолам [17]. В настоящото ни проучване използвахме друг метод на валидирана течна хроматография - тандемна масспектрометрия (LC – MS/MS), за да определим не само изходното съединение мидазолам, но и основните му метаболити 1-OH-мидазолам, 4-OH-мидазолам и 1 -ОН-мидазолам-О-глюкуронид. Оценихме ефекта от краткосрочно HFD и краткосрочно гладуване върху CYP3A4 и UGT-медииран метаболизъм, използвайки интравенозно приложен мидазолам като сонда.

Предмети и методи

Субекти

В проучването бяха включени девет здрави мъже. Субектите са включени, когато (1) са на възраст 18 години или повече; (2) здрави, определени от опитен лекар и с нормална бъбречна и чернодробна функция. Приложени са следните критерии за изключване: (1) тежко заболяване през последните 3 месеца, (2) стомашно-чревно заболяване, което може да повлияе на абсорбцията на лекарството, (3) анормални стойности на следните лабораторни параметри: аланин аминотрансфераза, алкална фосфатаза, аспартат аминотрансфераза, билирубин, гама-глутамил трансфераза и креатинин, (4) прекомерен прием на алкохол (> 3 единици алкохол на ден) или употреба на алкохол поне 2 дни преди всеки учебен ден, (5) злоупотреба с наркотици, (6) пушачи, (7) интензивни упражнения най-малко 3 дни преди всеки учебен ден, определени като повече от 1 час упражнения на ден, (8) използване на лекарства, отпускани по лекарско предписание или без рецепта, (9) консумация на храни или напитки, съдържащи кофеин 1 ден преди проучването и (10) консумация на грейпфрут и продукти, съдържащи грейпфрут или звездни плодове, най-малко 2 дни преди всеки учебен ден [6, 9].

Уча дизайн

Проведохме отворено, произволно назначено кръстосано интервенционно проучване при здрави мъже. След одобрение на протокола (изменение 2, ABRnr: NL40834.018.12) от институционалния съвет за преглед на етиката, това проучване беше проведено в Академичния медицински център, Университет в Амстердам, Холандия Всеки субект даде информирано съгласие за участие в проучването. Изследването е проведено в съответствие с Декларацията от Хелзинки.

Всеки субект получи еднократно интравенозно приложение на 0,015 mg/kg мидазолам (5 mg/ml, ампули от 1 ml, Roche Nederland BV, Woerden, Холандия) на три пъти с периоди на измиване от 4 седмици: (1) след една нощ бързо (контрол), (2) след 36 часа на гладно и (3) след еднодневно гладуване след 3-дневна хиперкалорична диета с високо съдържание на мазнини (HFD). Субектите бяха разпределени на случаен принцип за реда, в който са били подложени на интервенциите. Във всички случаи мидазолам е прилаган в 8:00 ч. Сутринта. Субектите са гладували от 22:00 ч., Предишната вечер, докато са участвали в контролната интервенция. При гладна интервенция субектите са гладували от 20:00 ч., Започвайки две вечери преди приложението на мидазолам. Това осигури период от 36 часа на гладно по време на приложението на мидазолам. Хиперкалоричната HFD се състои от собствената редовна диета на субекта, допълнена с 500 ml сметана (1715 kcal, 35% мазнини) след вечеря за период от 3 дни. Кремът е добавен след вечеря, за да се гарантира, че приемът на храна през деня не е засегнат.

За да стандартизират диетата си, субектите водеха дневник, съдържащ указания за диетата и бяха помолени да приемат подобни ястия през 3-те дни преди трите посещения. Съответствието с протокола за изследване също беше оценено чрез телефонни обаждания, текстови съобщения и имейл контакт по време на интервенциите. Освен това на изходно ниво бяха измерени следните биомаркери, за да се провери спазването на протокола на гладно: глюкоза, β-хидроксибутират, свободни мастни киселини и ацетоацетат [18]. Тъй като краткосрочният HFD предизвиква биохимични симптоми на чернодробна стеатоза, гама-глутамил трансфераза (GGT) и алкална фосфатаза (ALP) са измерени като биомаркери за хиперкалоричната HFD [10, 19]. Показано е, че нивата на алкална фосфатаза в серума се увеличават при затлъстяване в сравнение с лица, които не са със затлъстяване [20].

Във всеки от трите случая субектите имаха стандартно течно хранене (Nutridrink Compact; Nutricia, Zoetermeer, Холандия) по обяд. Храната беше стандартизирана, за да се предотвратят разликите в калорийния прием между интервенциите, за да се повлияе фармакокинетиката на мидазолам. След 16:00 ч. Субектите имаха право да консумират обичайната си диета [6].

Вземане на кръв и биоанализ на мидазолам и метаболити

За оценка на фармакокинетичните параметри, кръвните проби се събират преди дозата и при 2, 11,5, 15, 29, 41,5, 60, 90, 135, 173, 180 и 195 минути и 3,5, 4, 5, 7 и 9 h след интравенозно приложение на мидазолам. Плазмата се отделя чрез центрофугиране и се съхранява при - 80 ° С до анализ.

Фармакогенетичен анализ на CYP3A4 Полиморфизми

Геномна ДНК се изолира от пълноценна кръв, като се използва комплект за екстракция на обща нуклеинова киселина върху MagnaPure LC (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Германия). Генотипизирането е извършено с помощта на предварително проектирани DME Taqman анализи за алелна дискриминация на системата Life Technologies Taqman 7500. Всеки анализ се състои от две специфични за алела сонди за свързване на малки бразда (MGB), маркирани с флуоресцентни багрила VIC и FAM. Полимеразната верижна реакция (PCR) се извършва в реакционен обем от 10 ul, съдържащ специфични за анализ праймери, специфични за алела Taqman MGB сонди, Abgene Absolute QPCR Rox Mix и геномна ДНК (20 ng). Термичният профил се състои от 40 цикъла на денатурация при 95 ° C за 20 s и отгряване при 92 ° C за 3 s и удължаване при 60 ° C за 30 s. Генотиповете бяха оценени чрез измерване на специфична за алела флуоресценция, използвайки софтуера 7500 v2.3 за алелна дискриминация (Applied Biosystems). За CYP3A4 бяха тествани следните еднонуклеотидни полиморфизми (SNP): -392A> G (* 1B), g.20230G> A (* 1G), 664T> C (* 2), 1334T> C (* 3), 352A> G (* 4), 653G> C (* 5), 520G> C (* 10), 1117C> T (* 12), 566T> C (* 17), 878T> C (* 18) и g .15389C> T (* 22). Липсата на разследвани SNP даде заданието по алел по подразбиране „* 1A“.

Фармакокинетичен анализ

Фармакокинетичните данни бяха анализирани с помощта на нелинейния софтуер за моделиране на смесени ефекти NONMEM (Версия 7.2., Icon Development Solutions, Хановер, MD, САЩ). За визуализиране и оценка на моделите са използвани софтуер R [версия 64 3.0.1 (The R Foundation for Statistics Computing)] и Xpose версия 4. Софтуерът Pirana е използван като интерфейс между NONMEM, R и Xpose [22].

Структурен модел

Данните за концентрацията бяха логарифмично трансформирани за всички съединения; към данните бяха монтирани модели с едно, две и три отделения. Моделите на популацията са изградени поетапно. Следните параметри бяха количествено определени за изходното съединение мидазолам: клирънс (CL), хлабини между отделенията (Q1 и Q2) и обеми на разпределение на централното (V1) и периферните отделения (V2 и V3). За метаболитите на мидазолам очевидните клирънси и обемите на разпределение бяха количествено определени. Например, привидният клирънс на 1-OH-мидазолам се определя количествено като CL1-OH-MDZ /е1-OH-MDZ, където CL1-OH-MDZ представлява клирънсът на 1-OH-мидазолам и е1-OH-MDZ се образува фракцията на 1-OH-мидазолам. Привидният клирънс на 1-OH-мидазолам-О-глюкуронидът също зависи от фракцията на образувания 1-OH-мидазолам и може да бъде описан като CL1-OH-MDZ-Gluc/(е1-OH-MDZ-Gluc × е1-OH-MDZ), където CL1-OH-MDZ-Gluc представлява клирънсът на 1-OH-мидазолам-О-глюкуронид и е1-OH-MDZ-Gluc фракцията 1-OH-мидазолам се метаболизира до 1-OH-мидазолам-О-глюкуронид.

За оценките на всички параметри бяха оценени между- и вътрешно-индивидуалната променливост, като се приеме логарифмично нормално разпределение и се използва експоненциален модел на грешка [6, 24]. Остатъчната променливост е оценена с допълнителен модел на грешка.

Освен това, отделни области под стойностите на кривата на плазмена концентрация-време (AUC) са получени чрез post hoc анализ: байесов анализ за получаване на индивидуални фармакокинетични параметри на базата на популационните фармакокинетични параметри и индивидуалните наблюдавани концентрации. Излагането на мидазолам (AUCMDZ) зависи от приложената интравенозна доза мидазолам (DoseMDZ) и неговия клирънс (CLMDZ), както е описано от ур. 1:

Излагането на метаболити на мидазолам [AUC (м)] зависи от фракцията на образувания метаболит (е(м)), приложената доза мидазолам (DoseMDZ) и общият клирънс на метаболита (CL (м)) както е дадено от следните уравнения: