• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: [email protected]

Резюме

Обструктивната сънна апнея (OSA) все повече се свързва с инсулинова резистентност. Основната патофизиология остава неясна, но се предполага, че възпалението, медиирано от интермитентна хипоксия (IH) и последваща дисфункция на мастната тъкан, играе ключова роля.

хипоксия

Тествахме тази хипотеза, използвайки цялостен транслационен подход, използвайки миши IH модел на слаби и индуцирани от диета затлъстели мишки, иновативна IH система за клетъчни култури и строго контролирана кохорта от пациенти.

IH доведе до развитието на инсулинова резистентност при мишки, коригирана за степента на затлъстяване и намалено усвояване на глюкоза, медиирано от инсулин в адипоцитите на 3T3-L1, свързано с инхибиране на инсулиновия сигнален път и понижаване на регулацията на инсулиновия рецепторен субстрат-1 иРНК . Осигурявайки механистично прозрение, IH индуцира провъзпалителен фенотип на висцерална мастна тъкан при мишки с провъзпалителна поляризация на M1 макрофаги, корелираща със тежестта на инсулиновата резистентност. Безплатният in vitro анализ показа, че IH води до M1 поляризация на макрофагите, получени от THP1. При пациенти без съпътстващи заболявания (n = 186), OSA е независимо свързана с инсулинова резистентност. Освен това открихме независима корелация на тежестта на OSA с възпалителния маркер M1 макрофаг sCD163.

Това проучване предоставя доказателства, че IH индуцира провъзпалителен фенотип на мастната тъкан, което може да бъде решаваща връзка между OSA и развитието на инсулинова резистентност.

Резюме

Интермитентната хипоксия предизвиква възпалителен фенотип на мастната тъкан, което води до инсулинова резистентност при сънна апнея http://ow.ly/k1TX3091YBM

Въведение

Обструктивната сънна апнея (OSA) представлява голяма тежест за общественото здраве поради високото си разпространение [1] и значителна връзка със сърдечно-съдовата заболеваемост и смъртност [2, 3]. Освен това има нови доказателства за връзка между OSA и метаболитните смущения, и по-специално с промени в метаболизма на глюкозата, водещи до инсулинова резистентност (IR) и диабет тип 2 (T2D) [4-8].

Въпреки това, подробните механизми на взаимодействието между OSA и затлъстяването и специфичната роля на WAT в развитието на метаболитни състояния като IR в OSA остават слабо разбрани. По този начин ние предположихме, че IH допринася за патогенезата чрез индуциране на морфологични и функционални промени в мастната тъкан, стимулиращи възпалителен отговор. Тествахме хипотезата, използвайки изчерпателен транслационен подход, използващ миши модел на IH, модерна IH система за клетъчни култури и голямо човешко проучване, включващо добре фенотипизирани субекти без съпътстващи заболявания.

Методи

Подробни методи са описани в допълнителния материал.

Мъжки мишки C57Bl/6 (на 5 седмици) или са били хранени с диета с високо съдържание на мазнини, или с диета с ниско съдържание на мазнини в продължение на 14 седмици преди рандомизиране на IH (21–5% инспираторна фракция на кислород, цикъл от 60 s, 8 h на ден) както е описано по-рано [17] или контрол за 6 седмици. След приключване на протокола беше извършен интраперитонеален тест за толерантност към инсулин (ITT) [17]. Епидидималната мастна тъкан (EAT) беше събрана, обработена незабавно за изолиране на стромалната съдова фракция, култура или ex vivo инсулинова стимулация или съхранена за допълнителен анализ. Проведена е поточна цитометрия на стромалната съдова фракция, за да се определи количествено фракцията M1 и M2 на популацията на мастните макрофаги и е проведена F4/80 имунохистохимия за определяне на CLS плътността. Изследването е одобрено от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните (№ 02256.02) и мишките са поддържани в съответствие с Европейската конвенция за защита на гръбначните животни, използвани за експериментални и други научни цели.

Човешки изследвания

Общо 186 мъже без значителни съпътстващи заболявания са били наети от университетската болница „Сейнт Винсент“, Дъблин, Ирландия и университетската болница, Гренобъл, Франция. Изследването е одобрено от местните комисии по етика и всички участници са дали писмено информирано съгласие. Полисомнографията (PSG) се извършва, както е описано по-горе [10]. Глюкозният, инсулиновият и липидният профил на гладно се определят и нивата на циркулация на sCD163 се измерват с ELISA (R&D, Abingdon, UK). Индексът на устойчивост на модела на хомеостаза за оценка (HOMA-IR) се изчислява по уравнението: инсулин (mU · L -1) × глюкоза (mmol·L -1)/22,5.

In vitro модел на IH

Предишните модели на клетъчни култури на IH са били ограничени, като са изисквали продължително време на накисване, намален брой цикли и неадекватно контролно лечение. Тук разработихме модерен модел, използвайки система, създадена по поръчка (Coy Laboratories, Grass Lake, MI, USA), преодолявайки тези ограничения. Клетките се отглеждат върху полупропусклива мембрана (Lumox®; Sarstedt, Nuermbrecht, Германия), за да се позволи бърз обмен на газ. IH и контролна обработка бяха постигнати в два отделни затворени шкафа с газов поток, едновременно регулиран от автоматизиран външен контролер (Coy Laboratories). Протоколът IH се състои от редуващи се цикли от 40 s от 16% O2/5% CO2/баланс N2 и 40 s от 3% O2 ​​/ 5% CO2/баланс N2. Протоколът се прилага за 8 часа на ден в продължение на 3 последователни дни. Действителното парциално налягане на кислородните стойности в клетъчния монослой се наблюдава непрекъснато чрез флуоресцентна гасителна оксиметрия (Oxylite 2000; Oxford Optronix, Abingdon, UK). Контролната камера беше едновременно циклично обгазявана с 16% O2/5% CO2/баланс N2. И двете камери се държат в затворена жабка, поддържайки температурата на 37 ° C с отделни топлообменници, за да се осигури постоянна температура в IH и шкафовете за управление.

Клетъчна култура

3T3-L1 клетките се диференцират в зрели адипоцити съгласно инструкциите на производителя. Клетките NIH-3T3 (Panomics, Cambridge, UK), стабилно трансфектирани с репортерна конструкция NF-кВ-луцифераза, се поддържат в пълен DMEM, допълнен с хигромицин (100 μg · ml -1) (Roche, Clare, Ireland). Човешките моноцитни THP1 клетки (ATCC) се диференцират в макрофаги, като се използват 5 ng · ml -1 ml форбол 12-миристат 13-ацетат (РМА, Sigma) в продължение на 48 часа преди почивка в среда за 72 часа. След това клетките бяха оставени нестимулирани или инкубирани с интерферон (IFN) -γ (20 ng · mL -1, R&D) или липополизахарид (LPS) (1 ng · mL -1, Sigma) за 24 часа.

Статистически анализ

Интермитентната хипоксия (IH) води до инсулинова резистентност при слаби и диети със затлъстяване и възпрепятства усвояването на глюкоза, медиирано от инсулин, в адипоцитите. Слаби (LF) и индуцирани от диета затлъстели (HF) мишки бяха третирани с IH или контрола (N) в продължение на 6 седмици. Проведен е интраперитонеален тест за инсулинов толеранс (ITT) след 6 часа гладуване. а) ITT, представен за цялата несъвпадаща кохорта (n = 10–13 на група). б) ITT, представен за кохортата със затлъстели мишки, съобразени с телесно тегло (WM) (n = 7 на група). в) Площ под кривите (AUC). Данните са представени като средно ± sd. *: p +: p ¶: p 3 Транспортът на H-глюкоза впоследствие се наблюдава. г) Представена е промяна на сгъването спрямо базалното усвояване на глюкоза. п = 4; данните са представени като средно ± sd. *: p Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Базови характеристики на слаби (LF) и индуцирани от диета затлъстели (HF) мишки (цяла кохорта и съпоставени с теглото), лекувани с интермитентна хипоксия (IH) или контрол

Интермитентната хипоксия (IH) индуцира провъзпалителен фенотип във висцерална епидидимална мастна тъкан (EAT) при слаби и затлъстели мишки и поляризира получените от THP1 макрофаги към M1 провъзпалителен фенотип. Слаби (LF) и индуцирани от диета затлъстели (HF) мишки бяха третирани с IH или контрола (N) в продължение на 6 седмици. Получава се стромална съдова фракция на EAT (LF, n = 6; HF, n = 10 на група) и набирането на макрофаги на мастната тъкан (ATM) се определя чрез поточна цитометрия. Двойно положителните клетки (F4/80 +/CD11B +) се характеризират като ATM. От тях процентът на M1 макрофагите (F4/80 +/CD11B +/CD11C +/Cd206 dim) се проследява (а) и се корелира с нивото на инсулинова резистентност, определено от инсулиновия толерантен тест (ITT) (b). Процентът на М2 макрофагите (F4/80 +/CD11B +/CD11C -/Cd206 ярък) също беше оценен (c). Данните са представени като средно ± sd. *: p ¶: p +: p sem. *: p sd. *: p ¶: p +: p -1) или липополизахарид LPS (1 μg · ml -1). иРНК е събрана и обратна транскрипция преди PCR в реално време на M1-характерни гени. Данните са представени като средно ± sem. * p -2); група 2, клас затлъстяване 1 (ИТМ ≥30 и Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Изходни характеристики на човешката популация

Тежестта на обструктивната сънна апнея (OSA), определена от индекса на апнея/хипопнея (AHI), корелира значително и независимо със серумните нива на sCD163. За да се определи потенциалната роля на поляризацията на макрофагите на мастната тъкан към M1 провоспалителен фенотип при пациенти с OSA, ние измерихме циркулиращите серумни нива на CD163, установен маркер за активиране на макрофагите и M1 поляризация, при пациенти с OSA и контроли чрез ELISA (n = 149). Показана е корелация на sCD163 с тежестта на OSA, определена от индекса на апнея/хипопнея (AHI).

По този начин тежестта на OSA корелира значително със sCD163, което предполага поляризация на M1 макрофаги при пациенти с OSA.

Дискусия

В този доклад ние предоставяме доказателства от клетъчни култури, изследвания върху мишки и хора, че IH в OSA допринася независимо за развитието на IR. Също така за първи път демонстрираме, че IH индуцира подобни на затлъстяване морфологични провъзпалителни промени в мастната тъкан, които корелират с IR при слаби и затлъстели мишки и могат да допринесат за патогенезата на IR при пациенти с OSA.

Резултатите от нашето проучване са в съответствие с предишни доклади [4–6, 8, 21], подкрепящи независима асоциация на OSA с IR. Тези констатации се засилват от изключването на субекти със значителни смущаващи съпътстващи заболявания и набирането на участници в целия спектър от теглови категории. Ние вярваме, че липсата на статистическа значимост в HOMA-IR между OSA и контролите в група 3 се дължи на малкия брой контроли, субекти, които са особено трудни за набиране; като цяло, нашите данни показват, че OSA въздейства върху IR независимо от степента на затлъстяване.

Основната роля на IH в основната патогенеза се подкрепя от експерименти с мишки, демонстриращи намалена инсулинова чувствителност с IH. Предишни проучвания са провеждани главно при слаби мишки [17, 22–25]. D rager et al. [23] също съобщава за нарушена инсулинова чувствителност при индуцирани от диета затлъстели мишки, използващи индекса HOMA-IR като сурогатен маркер, който остава незасегнат от IH в нашите експерименти. Този параметър отразява баланса между отделянето на чернодробна глюкоза и секрецията на инсулин, което се поддържа чрез цикъл на обратна връзка между черния дроб и β-клетките, за разлика от ITT, който също оценява периферната чувствителност към инсулин на целевите тъкани, т.е. мастната тъкан и скелетните мускули [26]. При гризачите индексът HOMA-IR е по-малко чувствителен към промени в инсулиновата чувствителност [27] и докато D rager et al. [23] измерихме глюкоза на гладно и инсулин директно след спиране на IH, извършихме тези измервания след спиране на стимула за една нощ, което може да обясни несъответствието между двете проучвания.

Като ново откритие на нашето проучване установихме значителна корелация на тежестта на OSA с sCD163 като новопоявяващ се маркер на поляризацията на M1 макрофаги при хората. Въпреки че окончателна пряка връзка между повишените нива на sCD163, наблюдавани при пациенти с OSA, и мастната тъкан като източник не може да бъде извлечена на този етап, резултатите от животинския модел все пак предполагат, че това може да е така. В подкрепа на тази хипотеза, скорошно проучване показа значителна корелация на sCD163 с CD163 експресия в мастната тъкан [29]. CD163 се експресира върху М2 макрофаги, но за да стане разтворим е необходимо разцепване от ADAM-17, което зависи от М1 макрофаги [30]. Следователно sCD163 все повече се свързва с възпаление на мастната тъкан при инсулинова резистентност и T2D и е нововъзпалителен биомаркер на различни сърдечно-съдови заболявания [31–34]. Това е първото проучване, изследващо sCD163 в OSA и силно подкрепя доказателства за поляризация на макрофагите при това състояние. Неговата подробна роля в OSA и връзката директно с метаболитните и сърдечно-съдовите заболявания ще изискват допълнителна целева оценка, включително големи проспективни проучвания.

Нашето проучване има значителни силни страни, включително изчерпателния транслационен характер на проучването, което включва внимателно подбрана кохорта от пациенти, животински модел, който включва оценка на слаби и затлъстели мишки, и модерен ин витро модел на IH. Предишните модели на клетъчни култури на IH са били ограничени, като са изисквали продължително време на накисване, намален брой цикли и неадекватно контролно лечение. Тук моделите на кислородна десатурация наподобяват тези, наблюдавани в OSA, и по този начин този модел е далеч по-добър от предишните докладвани модели. C ampillo et al. [35] наскоро описаха подобен модел. Ние обаче признаваме, че моделът на IH може да се различава значително в различните тъкани. Едно проучване, използващо миши модел, предполага, че кислородните колебания на IH се отслабват в мастната тъкан [36]. Въпреки това, как това е свързано с човешката мастна тъкан, е неизвестно и е вероятно да има значителни локални разлики в тъканта в зависимост от относителното разстояние до кръвоносната система. Забележително е, че нашите открития, получени in vitro, много приличат на данните за животните, подкрепящи пригодността на този модел за адипоцити; необходими са обаче допълнителни целенасочени проучвания.

Едно потенциално ограничение на нашето проучване е единственият фокус върху мастната тъкан, но ние признаваме, че има вероятност други органи да участват в патогенезата на IR. IH също допринася за стеатохепатит [37, 38] и може също да има вреден ефект върху функцията на β-клетките [25]. По-нататъшни проучвания ще трябва да определят подробния принос на тези неблагоприятни действия при метаболитната дисфункция на глюкозата. Освен това не изследвахме потенциалния принос на други WAT отделения при мишки, различни от EAT, като подкожната и мезентериалната фракция. В клетъчната култура човешките първични подкожни и висцерални адипоцити имат сходен провъзпалителен потенциал в отговор на IH [16], но остава неизвестно дали други части на WAT се държат подобно на EAT in vivo. Друго потенциално ограничение е изключването на жени с OSA. Проектирахме проучването специално по този начин, за да избегнем различия между половете, които биха могли да повлияят на анализа. В резултат обаче нашите данни не могат да бъдат екстраполирани на жени.

В заключение, това проучване предоставя доказателства за провъзпалителни промени в мастната тъкан в отговор на IH, които могат да бъдат решаваща връзка между OSA и развитието на IR.

Допълнителен материал

Допълнителен материал

Моля обърнете внимание: допълнителният материал не се редактира от редакцията и се качва така, както е предоставен от автора.