И Джан

1 Изследователски отдел, Медицински център по въпросите на ветераните Malcom Randall, NF/SG HCS, Гейнсвил, Флорида

анорексия

2 Катедра по фармакология, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида

Рената Колазо

1 Изследователски отдел, Медицински център по въпросите на ветераните Malcom Randall, NF/SG HCS, Гейнсвил, Флорида

2 Катедра по фармакология, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида

Йонгсин Гао

1 Изследователски отдел, Медицински център по въпросите на ветераните Malcom Randall, NF/SG HCS, Гейнсвил, Флорида

2 Катедра по фармакология, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида

Банда Ли

1 Изследователски отдел, Медицински център по въпросите на ветераните Malcom Randall, NF/SG HCS, Гейнсвил, Флорида

2 Катедра по фармакология, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида

Philip J Scarpace

2 Катедра по фармакология, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида

Резюме

1. Въведение

2. Материали и методи

2.1 Реактиви

MTII е закупен от Phoenix Pharmaceuticals, Inc. (Burlingame, CA 94010) и разтворен в изкуствената церебрална гръбначно-мозъчна течност (ACSF) до крайна концентрация от 80 mM преди употреба.

2.2 Животни

Тримесечни мъжки плъхове F344 × Браун Норвегия са закупени от Harlan Sprague-Dawley (Indianapolis, IN). При пристигане плъховете бяха изследвани и останаха в карантина в продължение на една седмица. Грижите за животните са в съответствие с принципите на Ръководството за грижа и употреба на опитни животни. Плъховете бяха настанени поотделно с цикъл 12:12 часа светлина: тъмно (07:00 до 19:00 часа) и имаха свободен достъп до вода и стандартна диета с чау.

2.3 Централна инфузия на MTII

Плъховете се упояват с ксилазин, 8 mg/kg, s.c. и 5 минути по-късно, 90 mg/kg кетамин, i.p. докато се достигне стабилна хирургична равнина на анестезия. Аналгетикът Бупренорфин (0,05 mg/kg) се инжектира s.c. преди оперативна операция и отново 6 до 12 часа след операцията. MTII (1nmol/плъх/ден) или ACSF се въвежда чрез канюла за мозъчна инфузия, поставена стереотаксично в страничната камера (1,3 mm отзад на брегмата, 1,9 mm странично от средния заден шев и на дълбочина 3,5 mm) със скорост 0,5 ул/час. Канюлата беше свързана с подкожна осмотична мини помпа чрез катетър. Всички животни получиха ACSF през първите 10 дни от фазата на хирургично възстановяване след имплантиране на канюла. След това плъховете първо се вливат с MTII или носител в продължение на 14 дни (помпа 1). След това помпите в половината от вливаните в MTII плъхове бяха заменени с тези, съдържащи носител (MTII-On/Off), докато останалите бяха заменени с тези, съдържащи прясно MTII (MTII-On) в продължение на 10 дни (помпа 2). И накрая, помпите и в двете групи бяха заменени с нови, съдържащи пресен MTII за допълнителни 6 дни (помпа 3). Горната схема изобразява подробности за експеримента.

2.4 Събиране и подготовка на тъкани

Плъховете са умъртвени чрез цервикална дислокация под 85 mg/kg пентобарбитална упойка. Кръвните проби се събират чрез сърдечна пункция и серумът се събира чрез 10-минутно центрофугиране в серумни сепараторни епруветки. Кръвоносната система беше перфузирана с 20 ml студен физиологичен разтвор и кафява мастна тъкан (BAT), периренална и ретроперитонеална бяла мастна тъкан (PWAT и RTWAT) и хипоталамусът беше изрязан. Хипоталамусът е отстранен чрез извършване на разрез, медиален до пириформени лобове, каудален на оптичния хиазъм и отпред на церебралната смазка на дълбочина 2-3 mm [22]. Хипоталамите се обработват с ултразвук за кратко в 0,3 ml 10 тМ Tris-HCL, рН 6,8, 2% SDS и 0,08 μg/ml окадаинова киселина в присъствието на протеазните инхибитори, 1 тМ PMSF, 0,1 тМ бензамидин и 2 цМ левпептин. Аликвотна част от 100 ul хомогенат се отстранява и замразява за изолиране на РНК. Останалият хомогенат незабавно се вари и се съхранява замразен при -80 ° С за Western анализ. Концентрациите на протеини се определят с помощта на комплекта за анализ на DC протеини (Bio-Rad, Hercules, СА). Пробите от НДНТ и WAT бяха филтрирани през филтър за спринцовки с 0.45 микрона (Whatman, Clifton, NJ), за да се отстранят липидните частици преди измерванията на протеина.

2.5 Западен анализ

Отделянето на протеин 1 (UCP1) в BAT хомогенати беше измерено с анти-човешко UCP1 антитяло (Linco Research, St. Charles, MO) [15]. За да се определи фосфорилираната ацетил-КоА карбоксилаза 1 (P-ACC1) и общата ACC1 в PWAT, протеиновият хомогенат (20 - 50 μg) се оценява или с моноклонално антитяло, специфично за P-ACC (Upstate Cell Signaling Solutions, Lake Placid, NY) или конюгирано със Streptavidin-HRP антитяло (при разреждане 1: 10 000), специфично за свързания с биотин общ ACC1 (PIERCE Biotechnology, Rockford, IL), и визуализирано чрез подобрено хемилуминесцентно откриване (ECL-plus, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

2.6 RT-PCR

2.7 Статистически анализ