Отделение по микробиология и токсикология на околната среда, Калифорнийски университет Санта Круз, Санта Круз, Калифорния, Съединени американски щати

съществено

Настоящ адрес: Микробиология за контрол на качеството, Genentech Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, САЩ

Отделение по микробиология и токсикология на околната среда, Калифорнийски университет Санта Круз, Санта Круз, Калифорния, Съединени американски щати

Отделение по микробиология и токсикология на околната среда, Калифорнийски университет Санта Круз, Санта Круз, Калифорния, Съединени американски щати

Биомолекулярно инженерство, Калифорнийски университет, Санта Круз, Санта Круз, Калифорния, Съединени американски щати

Отделение по биомолекулярна химия, Университет на Уисконсин-Медисън, Медисън, Уисконсин, Съединени американски щати

Настоящ адрес: Инфекциозен отдел на Roche Molecular Systems, Inc., Плезантон, Калифорния, Съединени американски щати

Отделение по микробиология и токсикология на околната среда, Калифорнийски университет Санта Круз, Санта Круз, Калифорния, Съединени американски щати

Отделение за молекулярна, клетъчна и биология на развитието, Калифорнийски университет Санта Круз, Санта Круз, Калифорния, Съединени американски щати

Настоящ адрес: Maverix Biomics, Inc., Сан Матео, Калифорния, Съединени американски щати

Биомолекулярно инженерство, Калифорнийски университет, Санта Круз, Санта Круз, Калифорния, Съединени американски щати

Отделение по биомолекулярна химия, Университет на Уисконсин-Медисън, Медисън, Уисконсин, Съединени американски щати

Биомолекулярно инженерство, Калифорнийски университет, Санта Круз, Санта Круз, Калифорния, Съединени американски щати

Отделение по микробиология и токсикология на околната среда, Калифорнийски университет Санта Круз, Санта Круз, Калифорния, Съединени американски щати

  • Хали К. Милър,
  • Лора Куан,
  • Лия Швисоу,
  • Дейвид Л. Берник,
  • Ерин Метерт,
  • Хектор А. Рамирес,
  • Джеймс М. Рейгъл,
  • Патриша П. Чан,
  • Патриша Дж. Кайли,
  • Тод М. Лоу

Фигури

Резюме

Резюме на автора

Бактериалните патогени използват регулатори, които усещат сигналите на околната среда, за да подобрят своята годност. Тук ние идентифицираме транскрипционен регулатор в човешкия чревен патоген, Yersinia pseudotuberculosis, който контролира специализирана система за секреция, необходима за растежа на бактериите в тъканите на бозайници. Този регулатор е показан при други бактериални видове да променя неговата активност в отговор на промените в концентрацията на желязо и оксидативен стрес, но никога не е изследван в Йерсиния. Важно е, че Y. pseudotuberculosis изпитва големи промени в бионаличността на желязо при преминаване от червата към по-дълбоки тъкани и желязото е критичен компонент в вирулентността на Yersinia, тъй като хората с нарушения на претоварването с желязо имат повишена чувствителност към системни инфекции на Yersinia. Нашата работа поставя този модулиран с желязо транскрипционен регулатор в регулаторната мрежа, която контролира експресията на вирулентен ген в Y. pseudotuberculosis, идентифицирайки го като потенциална нова цел за антимикробни агенти.

Цитат: Miller HK, Kwuan L, Schwiesow L, Bernick DL, Mettert E, Ramirez HA, et al. (2014) IscR е от съществено значение за Yersinia pseudotuberculosis тип III секреция и вирулентност. PLoS Pathog 10 (6): e1004194. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004194

Редактор: Парто Гош, Калифорнийски университет, Сан Диего, Съединени американски щати

Получено: 5 август 2013 г .; Прието: 6 май 2014 г .; Публикувано: 12 юни 2014 г.

Финансиране: Това проучване беше подкрепено от Националния здравен институт (www.NIH.gov) безвъзмездна помощ AI099747 (за VA) и безвъзмездна помощ GM045844 (за PJK) и Програма Хелман стипендианти (www.hellmanfellows.org) (за VA). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Системите за секреция тип III (T3SS) са важни компоненти в прогресията на заболяването за редица клинично значими човешки патогени, включително тези от родовете Shigella, Salmonella, Escherichia, Chlamydia, Vibrio, Pseudomonas и Yersinia [1], [2] . T3SS функционира като инжекционен, който доставя бактериални ефекторни протеини директно в клетъчната цитоплазма на гостоприемника [2]. Докато самият апарат T3SS е структурно запазен, репертоарът на ефекторните протеини T3SS, използвани от всяка група патогени, е различен [2]. По този начин ефектът на T3SS върху гостоприемника е уникален за нуждите на патогена [2]. Докато T3SS обикновено е от съществено значение за експресиращия T3SS патоген да причини заболяване, няколко аспекта на T3SS могат да бъдат вредни за бактериалния растеж [2]. Например, T3SS компонентите се разпознават от имунната система на гостоприемника [3], [4]. В допълнение, експресията на T3SS е енергийно скъпа и при някои организми индукцията на T3SS корелира със спирането на растежа [5]. Следователно регулирането е от съществено значение за правилната функция на T3SS, за да се гарантира, че то се появява само по време на контакт с клетката гостоприемник в подходящата гостоприемна тъкан [2], [6].

В това проучване изолирахме два независими мутанти за вмъкване на транспон на IscR в нов екран за гени на Y. pseudotuberculosis, важни за функцията T3SS. Оценихме въздействието на делецията на iscR върху Y. pseudotuberculosis in vitro и in vivo растеж, секреция тип III и глобална генна експресия. Открихме, че IscR е от съществено значение за пълната функция на T3SS и вирулентността в миши модел на инфекция. В допълнение, ние предоставяме доказателства, че IscR контролът на T3SS произтича от директната транскрипционна регулация на главния регулатор TcSS LcrF.

Резултати

IscR е необходим за Y. pseudotuberculosis Ysc T3SS функция

(A) Y. псевдотуберкулозната ДНК последователност, която показва уникалните места за вмъкване на двата транспозонни мутанти, генерирани от нашия генетичен екран. Интервал в последователността на ДНК и плътна черна линия показват мястото на вмъкване за iscR: Tn1 или iscR: Tn2. (Б.) Извършено е многократно подравняване на последователността на протеиновата последователност IscR от E. coli K12-MG1655 и всеки от трите патогенни за човека Yersinia spp., Y. pseudotuberculosis IP 32953 (Y. pstb), Y. enterocolitica 8081 (Y. ent) и Y. pestis CO92 (Y. pestis) с помощта на ClustalW [86]. ДНК-свързващият мотив на N-крайната спирала-превъртане-спирала е обозначен с черна кутия. Трите запазени цистеинови остатъка (C92, C98 и C104), отговорни за координирането на Fe-S клъстер, са получер и са идентифицирани с черни стрелки [33]. Звездичките показват нуклеотиди, които са запазени и при четирите вида.

За да потвърдим, че загубата на IscR в Y. псевдотуберкулозата води до T3SS дефекти, изолирахме двата iscR транспозонни мутанти (iscR: Tn1 и iscR: Tn2) от нашата библиотека и отново измерихме способността им да задействат NFκB активиране в HEK293T клетки в сравнение с родителския щам Δyop6 и ΔyscNU T3SS-нулев мутант [43]. В допълнение, ние конструирахме мутант на делеция на iscR в рамките на Δyop6 генетичния фон (Δyop6/ΔiscR) и го тествахме в този анализ. Установихме, че нарушаването на iscR води до ∼ 2 пъти по-малко активиране на NFκB спрямо родителския щам Δyop6 T3SS +, въпреки че нивата на активиране на NFκB все още са 5 пъти по-високи от щам с пълна липса на функция T3SS (ΔyscNU; Фигура 2А), което предполага, че загубата на iscR води до частична загуба на T3SS.

За да проверим по-нататък, че заличаването на iscR води до промени във функцията на T3SS, ние оценихме способността на мутанта Δyop6/ΔiscR да вмъква пори YopBD в мембраните на целевите клетки гостоприемници чрез измерване на навлизането на етидиев бромид (EtBr) в костния мозък, инфектиран с псевдотуберкулоза. производни макрофаги [45], [46]. Образуването на пори от мутанта Δyop6/ΔiscR е намалено със 7 пъти (p 8 CFU или от див тип Y. pseudotuberculosis, или от изогенни мутантни щамове ΔiscR. На 5 дни след инокулацията мишките, заразени с мутанта ΔiscR, показват значително намалена колонизация на Пластирите на Peyer и мезентериалните лимфни възли (MLN), както и намалената системна колонизация (Фигура 3). По-конкретно, забелязахме 10- и 130-кратно намаляване на CFU, възстановено от пластирите на Peyer и MLNs, съответно, при мишки, заразени с мутант ΔiscR щам спрямо дивия тип. По-специално, наблюдавахме 1000- до 10 000-кратно намаляване на бактериалното натоварване в далака и черния дроб съответно. Намалената способност на мутантния щам ΔiscR да колонизира дълбоки тъканни места се подчертава от факта, че бактериите не са били открити в седем от деветте анализирани черни дробове.Тези открития предполагат, че IscR е от съществено значение за Y. pseudotuberculosis virulence в модел на орална инфекция.

Мишките бяха заразени с 2 × 10 8 CFU от WT Y. pseudotuberculosis или ΔiscR мутант чрез орогастрален сондаж. На 5 дни след инокулацията се събират пластирите на Peyer (PP), мезентериалните лимфни възли (MLN), далаците и черния дроб, хомогенизират се и се определя CFU. Всеки символ представлява едно животно. Неизпълнените символи показват, че CFU са били под границата на откриване. Представените данни са от три независими експеримента. * p Фигура 4. IscR влияе върху глобалната генна експресия при Y. pseudotuberculosis при условия на насищане с желязо.

Анализът на RNAseq беше извършен върху WT и ΔiscR Y. псевдотуберкулоза след растеж в M9 при 37 ° C в продължение на 3 часа (T3SS-индуциращи условия), след което общата РНК беше събрана и обработена. Получените библиотеки бяха секвенирани, използвайки платформа за секвениране HiSeq2500 Illumina за 50 bp единични четения и анализирани чрез приложението CLC Genomics Workbench (CLC bio). Нивата на експресия на RPKM на 225 гена демонстрират гъвкава промяна от ≥2 и се считат за значими чрез тест Bayseq с коригиран FDR post hoc тест от три независими експеримента (p ≤ 0,05). Показани са функционалните онтологии на (A) 133 гена, които са регулирани нагоре в ΔiscR мутанта спрямо дивия тип и (Б.) 92, които са регулирани надолу.

Количествен PCR анализ в реално време на WT и ΔiscR Y. Псевдотуберкулозата е извършена (A) за Fe-S клъстерните гени за биогенеза, iscS и erpA и (B) за гените T3SS, yscF, yscN и lcrF. Проведени са експерименти с култури, отглеждани в М9 при 37 ° С в продължение на 3 часа. Показани са средните стойности ± SEM от три независими експеримента. * p Таблица 1. Гени, потиснати от IscR, идентифицирани чрез анализ на RNAseq.

IscR е необходим за транскрипция на T3SS гени

Общо 92 гена са значително регулирани надолу в ΔiscR мутанта спрямо дивия тип Y. pseudotuberculosis (Таблица 2). Тези данни показват, че по-голямата част от pYV-кодираните гени са намалени в ΔiscR мутанта спрямо щама от див тип, включително гени, необходими за правилната експресия и функция на T3SS. Опероните virC и lcrGVH-yopBD, както и гените, кодиращи товарния T3SS YopHEMOJTK, бяха най-засегнати при изтриването на iscR: ефекторните протеини YopJ (-3.4 пъти), YopM (-5.3 пъти) и YopT (-5.5 пъти) ), ефекторният протеин и регулаторът на транслокация YopK (-9,3 пъти), както и редица гени, кодиращи структурни протеини на T3SS. Гените, кодиращи регулатори, които контролират експресията и функцията на T3SS, бяха намалени при мутанта, включително lcrQ (-2,1-кратно), lcrF (-3,3-кратно), lcrG (-2,8-кратно) и lcrH (-3,9-кратно). За да потвърдим, че експресията на гена T3SS наистина е намалена в мутанта ΔiscR, измерихме нивата на транскрипт на гените, кодиращи структурни протеини T3SS YscN, YscF и T3SS транскрипционен регулатор LcrF чрез qRT-PCR. Както е описано подробно на Фигура 5В, наблюдаваме намаляване на гънките от 2,8 пъти (p Фигура 6. Мутантният щам apo-IscR показва намалена подвижност и нарушаване на електрическия потенциал.

IscR разпознава мотив от тип 2 нагоре от оперона yscW-lcrF

За да започнем да разбираме естеството на T3SS дефекта в присъствието само на apo-IscR, извършихме RNAseq анализ на Y. pseudotuberculosis апо-заключен IscR мутант, отгледан при T3SS-индуциращи условия и сравнихме резултатите с данни от див тип и ΔiscR щамове. Любопитното е, че апо-заключеният IscR мутант показва анормална експресия на гени, участващи в реакция на стрес, транспорт, клетъчна обвивка, както и електронен транспорт (данните не са показани). Трябва да се отбележи, че Fe-S клъстерните биосинтезни протеини, кодирани в iscRSUA-hscBA-fdx-iscX-pepB-sseB, yadR/erpA и nfuA оперони, са значително увеличени на този фон, подобно на този на мутантния щам ΔiscR (Фигура S2A), което показва, че holo-IscR потиска експресията на тези гени при използваните аеробни условия, пълни с желязо. За разлика от това се наблюдават увеличения на оперона за клетъчна биогенеза на sufABCDS Fe-S за апо-заключения IscR щам в сравнение както с дивия тип, така и с ΔiscR щамовете (Фигура S4). Тъй като IscR е свръхекспресиран от 30 пъти (p Фигура 7. Y. pseudotuberculosis без функционален IscR дисплей намалява транскрипцията на редица pYV кодирани гени.

Средни и вътрешни пръстени: топлинна карта [83] представяне на log2-съотношения (log2 (RPKMmutant/RPKMwt) за всеки ген в pYV плазмида както за мутантите ΔiscR (среден пръстен), така и за апо-IscR (вътрешен пръстен) спрямо дивия тип. Външен пръстен: pYV базова координатна позиция от Y. pseudotuberculosis IP32953. Идентифицирани са известни гени и опероните virA, virB и virC са подчертани с черни дъги. От вътрешната дясна страна е легендата на цветната лента, показваща log2-съотношения от -3,5 до 2. Използвайки тази скала, оранжево/червено оцветяване представляват гени с намалена транскрипция в мутанта спрямо щама от див тип, а синьо/зелено оцветяване представлява увеличаване на генната транскрипция за мутанта спрямо дивия тип. Тен/крем не означава промяна.

Дискусия

В това проучване ние представяме първата характеристика на регулатора на блясък на ронен улфур, IscR, на Йерсиния. Първоначално идентифициран чрез генетичен екран за модулатори на Ysc T3SS функция, дефицит на iscR Y. pseudotuberculosis имаше драматичен дефект в секрецията на T3SS ефекторни протеини и при насочване към макрофагите през техния T3SS, но показваше нормален растеж в бульонната култура и подвижността на бичеви диви видове. Биоинформатичният и ДНК свързващ анализ разкрива IscR свързващо място нагоре по веригата на оперона, кодиращ T3SS главен регулатор LcrF, което показва, че IscR контролира експресията на Ysc T3SS. Колективно тези открития показват, че IscR е централен компонент на регулаторната каскада на Y. pseudotuberculosis T3SS.

Не е ясно защо заключването на IscR в апо-заключена форма води до дефект на протонната подвижна сила. Наблюдавахме ∼ 9 пъти повече suf транскрипт в апо-заключения IscR мутант в сравнение с щама ΔiscR, който няма дефект на протонната движеща сила, докато isc оперонът беше експресиран в еднаква степен и при двата мутанта. Ezraty et al. наскоро показа, че експресията на суф, но не на isc, оперон в Е. coli води до дефект на протонната двигателна сила, вероятно в резултат на нарушено натоварване на Fe-S клъстери в аеробни дихателни комплекси [55]. Въпреки че isc оперонът се експресира в апо-заключен Y. псевдотуберкулозен мутант, може би свръхекспресията на suf пътя води до неправилно сглобяване на Fe-S комплексите на електронната транспортна верига, които задвижват протонната движеща сила.

В обобщение, представяме първата характеристика на регулатора на блясък на iron-ulfur, IscR, на Йерсиния. Ние разкриваме, че IscR регулира гените, участващи в сглобяването на Fe-S клъстера по начин, подобен на този на E. coli. Най-забележително е, че демонстрираме, че мутацията на IscR води до намалена функция на Y. pseudotuberculosis T3SS и че това се дължи на намаляване на транскрипцията на гени, кодиращи структурни, регулаторни и ефекторни протеини. Освен това представяме доказателства, показващи, че IscR е от съществено значение за вирулентността на Y. pseudotuberculosis и че това затихване вероятно се дължи отчасти на директното регулиране на T3SS от IscR. Колективно това проучване аргументира важната и нова роля на IscR в вирулентността на Y. pseudotuberculosis, както и регулирането на Ysc T3SS, и идентифицира IscR като потенциална цел за нови антимикробни агенти.

Материали и методи

Всички процедури за използване на животни бяха в строго съответствие с Ръководството на NIH за грижа и употреба на лабораторни животни и бяха одобрени от институционалния комитет по грижа и употреба на животните на UCSC.

Бактериални щамове, плазмиди и условия на растеж

Всички щамове, използвани в това проучване, са изброени в таблица 3. Y. псевдотуберкулозните щамове са отгледани или в 2xYT, или в M9 минимална среда, допълнена с казаминокиселини [68], наричана тук M9, при 26 ° C с разклащане при 250 rpm, посочено друго. Когато е посочено, синтезът на Yop се индуцира чрез обратно разреждане на култури или в M9, или в среда с ниско съдържание на калций (2xYT плюс 20 mM натриев оксалат и 20 mM MgCl2) до OD600 от 0,2 и се отглежда в продължение на 1,5 часа при 26 ° C/разклащане, последвано от 2 часа при 37 ° C/разклащане, както е описано по-горе [69].