Показатели: PDF 577 преглеждания | HTML 1056 изгледи | ?

галанинов

Олег Писаренко, Андрей Тимотин, Мария Сидорова, Ирина Студнева, Валентин Шулженко, Марина Палкеева, Лариса Серебрякова, Александър Молокоедов, Оксана Веселова, Матие Синато, Фредерик Боал, Хелене Трончере и Оксана Кундузова _

Резюме

Олег Писаренко 1, *, Андрей Тимотин 2, 3, *, Мария Сидорова 1, Ирина Студнева 1, Валентин Шулженко 1, Марина Палкеева 1, Лариса Серебрякова 1, Александър Молокоедов 1, Оксана Веселова 1, Матие Синато 2, 3, Фредерик Боал 2, 3, Хелене Трончере 2, 3 и Оксана Кундузова 2, 3, *

1 Руски кардиологичен изследователски и производствен комплекс, Москва, Руска федерация

2 Национален институт за здраве и медицински изследвания (INSERM) U1048, Тулуза, Франция

3 Университет в Тулуза, UPS, Институт по метаболитни и сърдечно-съдови заболявания, Тулуза, Франция

* Тези автори са допринесли еднакво за тази работа

Ключови думи: галанин (2-15); апоптоза; сърдечно увреждане; енергиен метаболизъм; оксидативен стрес

Получено: 02 август 2017 г. Прието: 04 септември 2017 г. Публикувано: 05 октомври 2017 г.

Предистория и цел: Галанинът е ендогенен пептид, участващ в различни физиологични функции в централната нервна система, включително централна сърдечно-съдова регулация. Настоящото проучване е предназначено да оцени потенциалните ефекти на краткия N-терминален галанинов фрагмент 2-15 (G) върху сърдечна исхемия/реперфузия (I/R) нараняване.

Експериментален подход: Пептид G се синтезира чрез автоматичен твърдофазен метод и се идентифицира чрез 1Н-ЯМР спектроскопия и масспектрометрия. Проведени са експерименти върху култивирани клетки на кардиомиобласт на плъхове (H9C2), изолирани перфузирани работещи сърца на плъхове и обезболени плъхове.

Ключови резултати: Клетъчната жизнеспособност се е увеличила значително след третиране с 10 и 50 пМ G пептид. При условия на хипоксия и реоксигениране излагането на клетки H9C2 на G пептид намалява клетъчната апоптоза и производството на реактивни кислородни митохондриални видове (ROS). Постихемичната инфузия на G пептид намалява увреждането на клетъчната мембрана и подобрява функционалното възстановяване в изолирани сърца по време на реперфузия. Тези ефекти бяха придружени от засилено възстановяване на метаболитното състояние на миокарда. Лечението с G пептид в началото на реперфузията индуцира незначителни промени в хемодинамичните променливи, но значително намалява размера на инфаркта и плазмените нива на маркери на некроза.

Заключение и последици: Тези открития предполагат, че G пептидът е ефективен за смекчаване на сърдечно-съдови увреждания, като по този начин предоставя обосновка за обещаващ инструмент за лечение на сърдечно-съдови заболявания.

ВЪВЕДЕНИЕ

Галанинът, 29/30 аминокиселинен невропептид, е широко разпространен в централната и периферната нервна система, както и в ендокринната система, за предпочитане в мозъка, хипоталамуса, хипофизата и други тъкани, включително сърцето. Галанинергичната система участва в множество регулаторни функции, включително централен сърдечно-съдов контрол [1]. N-крайните фрагменти на галанин са от решаващо значение за неговата биологична активност и първите 15 аминокиселини са запазени в повечето видове [2], докато С-крайният регион (остатъци 17-29) варира между видовете и липсва рецепторен афинитет [2] . Към днешна дата три галанинови рецептора (GalR1, GalR2 и GalR3), членове на суперсемейството на GPCR, са идентифицирани чрез молекулярно клониране и фармакологично характеризирани [3].

Следователно ние имахме за цел да изследваме ефектите на G пептида върху инвитро в клетъчна линия на кардиомиобласт H9C2, подложена на хипоксия/реоксигенация (H/R), ex vivo в изолирани сърца с перфузионни плъхове и in vivo в модел на плъх на I/R нараняване.

РЕЗУЛТАТИ

Ефектите на G върху оцеляването на клетките H9C2 в отговор на стрес

За да определим дали G влияе на жизнеспособността на клетките, ние изследвахме дозозависимите ефекти на пептида върху H2O2-индуцираната загуба на ATP в H9C2 клетките. Както е показано на Фигура 1, излагането на клетки на 400 μM H2O2 в продължение на 4 часа доведе до значително намаляване на жизнеспособността на клетките в сравнение с контрола. Проучванията с отговор на дозата разкриват, че G в дози от 10 и 50 nM е в състояние да предотврати индуцирано от H2O2 намаляване на нивата на ATP. След това изследвахме чрез анализ на TUNEL дали G влияе на апоптотичната клетъчна смърт в отговор на хипоксичен стрес. Тъй като 50 nM G произвеждат приблизително 20% увеличение на жизнеспособността на кардиомиобластите, ние използвахме тази концентрация в следващите експерименти. Както е показано на Фигура 2, излагането на H9C2 клетки на хипоксия причинява увеличаване на броя на TUNEL-положителните клетки в сравнение с нормоксията. Въпреки това, лечението на клетки с 50 nM G значително намалява индуцираната от хипоксия апоптоза (Фигура 2).

Фигура 1: Зависим от дозата ефект на G върху жизнеспособността на клетките в отговор на оксидативен стрес. Лечението на кардиомиобласти с G предотвратява индуцирано от H2O2 намаляване на клетъчната жизнеспособност по зависим от дозата начин. H9C2 бяха предварително обработени с G (10, 50, 250 nM) за 20 минути и след това изложени на 400 μM H2O2 в продължение на 4h. Стойностите са средните стойности ± SEM за три експеримента. * P ** P §§§ P Фигура 2: Ефект на G върху индуцирана от хипоксия клетъчна апоптоза. (А) Представителни флуоресцентни изображения на H9C2 клетки, предварително обработени с 50 nM G в продължение на 20 минути и след това изложени на нормоксия или хипоксия-реоксигениране. Апоптозата се измерва чрез TUNEL анализ в H9C2 клетки след 16 часа хипоксия, последвана от 3 часа реоксигениране. (Б) Количествен анализ на TUNEL-положителни клетки в H9C2 клетки. Стрелките показват апоптотични клетки. Стойностите са средните стойности ± SEM от три експеримента. *** P §§§ P - ) производство с използване на флуоресцентна сонда MitoSOX Red. Както е показано на Фигура 3А, 3В, излагането на клетки на хипоксичен стрес причинява значително увеличение на производството на О2 в сравнение с нормоксия. Важно е, че лечението на H9C2 клетки с 50 nM G значително предотвратява индуцираното от хипоксия образуване на O2 (Фигура 3).

Фигура 3: Ефект на G върху индуцирана от хипоксия митохондриална O2 - продукция. (А) Представителни флуоресцентни изображения на H9C2 клетки, предварително обработени с G пептид. Образуването на митохондриален O2 се оценява чрез MitoSOX RED в H9C2 клетки, изложени на 16h хипоксия, последвано от 3h реоксигениране. (Б) Количествен анализ на производството на O2 в клетки H9C2, изложени на нормоксия или хипоксия-реоксигенация. Стойностите са средните стойности ± SEM от три експеримента. * P ## P Фигура 4: Ефекти на концентрациите на пептид G в KHB върху възстановяването на сърдечния дебит (А) и индекса на интензивността на съкратителната функция (Б) в края на реперфузията. Стойностите са средни стойности ± SEM от 8 експеримента и се изразяват в процент от първоначалната стойност. CO, сърдечен дебит; LVDP × HR, индексът на интензивността на контрактилната функция. Пунктираните линии показват възстановяване на контролните индекси.

Таблица 1: Ефект от инфузията на 225 μM G след глобална исхемия върху възстановяването на изолирани топлинни плъхове в края на реперфузията