Отдел за когнитивна наука, Пекински институт по основни медицински науки, Пекин, Китай Китай

кетогенната

Отдел за когнитивна наука, Пекински институт по основни медицински науки, Пекин, Китай Китай

Отдел за когнитивна наука, Пекински институт по основни медицински науки, Пекин, Китай Китай

Отдел за когнитивна наука, Пекински институт по основни медицински науки, Пекин, Китай Китай

Отдел за когнитивна наука, Пекински институт по основни медицински науки, Пекин, Китай Китай

Отдел за когнитивна наука, Пекински институт по основни медицински науки, Пекин, Китай Китай

Отдел за когнитивна наука, Пекински институт по основни медицински науки, Пекин, Китай Китай

Отдел за когнитивна наука, Пекински институт по основни медицински науки, Пекин, Китай Китай

Отдел за когнитивна наука, Пекински институт по основни медицински науки, Пекин, КНР, Център за съвместни иновации по неврорегенерация, Университет Нантонг, Нантонг, JS, Китай, Пекински институт за мозъчни разстройства, 10 Xitoutiao, You Anmen, Fengtai District, Пекин, ПР Китай

Отдел за когнитивни науки, Институт по основни медицински науки в Пекин, Пекин, Китай, Център за съвместни иновации по неврорегенерация, Университет Нантонг, Нантонг, JS, Китай

  • Минг Джао,
  • Син Хуанг,
  • Ксианг Ченг,
  • Сяо Лин,
  • Тонг Джао,
  • Liying Wu,
  • Сяодан Ю,
  • Kuiwu Wu,
  • Минг Фен,
  • Lingling Zhu

Фигури

Резюме

Цитат: Zhao M, Huang X, Cheng X, Lin X, Zhao T, Wu L, et al. (2017) Кетогенната диета подобрява пространственото увреждане на паметта, причинено от излагане на хипобарна хипоксия чрез повишено ацетилиране на хистони при плъхове. PLoS ONE 12 (3): e0174477. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0174477

Редактор: Мишел М. Адамс, Университет Билкент, ТУРЦИЯ

Получено: 12 декември 2016 г .; Прието: 9 март 2017 г .; Публикувано: 29 март 2017 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни са в хартията.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Националната фондация за естествени науки на Китай, грант # 81430044, 31271205, 31271211 (http://www.nsfc.gov.cn/); общинската комисия за наука и технологии в Пекин, грант # Z161100000216134 (http://www.bjkw.gov.cn/n8785584/index.html) и Националната програма за основни изследвания на Китай, грант # 2012CB518200 (http: //program.most .gov.cn /). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

В допълнение към активирането на хипоксия-индуцируемия фактор-1 (HIF-1) път, хипоксията провокира и различни епигенетични механизми, участващи в генната експресия [12]. Неотдавнашен доклад установи, че хипобаричната хипоксия има диференциални ефекти върху ацетилирането на протеини в неокортекса и хипокампуса на мозъка на плъхове и че преобладаващите цели за това ацетилиране изглежда са хистоните [13]. Обратното намаляване на хистоновото ацетилиране може да бъде ефективен метод за облекчаване на наранявания, причинени от хипобарна хипоксия. Предложихме, че KD може да подобри когнитивната дисфункция, причинена от хипобарна хипоксия чрез модифициране на хистоновото ацетилиране. В настоящото проучване установихме, че приложението на KD не само подобрява пространственото обучение при възрастни плъхове, но и обръща пространственото увреждане на паметта, причинено от хипобарична хипоксия. Нещо повече, намаляването на хистоновото ацетилиране, индуцирано от хипоксия, е обърнато чрез лечение с KD. Тези открития показват, че KD може да предпази от увреждане на паметта, причинено от излагане на хипобарна хипоксия.

Материали и методи

Декларация за етика

Всички експериментални процедури са одобрени от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните към Пекинския институт по основни медицински науки и са извършени в съответствие с указанията. По време на лечението бяха разработени поведенчески тестове и процедури за събиране на тъкани, за да се сведе до минимум потенциалната болка и дистрес на животните, използвани в това проучване. Всички плъхове са били често наблюдавани, поне три пъти седмично, за здравословно състояние.

Животни и лечение

Осемседмични мъжки плъхове Sprague Dawley, закупени от Vital River Laboratory Animal Technology Co. (Пекин, Китай), бяха настанени в стая с контролирана температура и влажност. Плъховете се поддържат в рамките на 12-часов цикъл светлина-тъмнина и им се дава храна и вода ad libitum. Преди експериментите, плъховете бяха оставени да се аклиматизират в продължение на три дни. Плъховете са гладували през нощта, преди да бъдат разпределени в две групи, хранени или със стандартната диета за отглеждане/поддържане (STD), или с KD (закупена от и произведена съответно от Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.). Съставът на KD в предишен доклад е използван тук [14] и е показан в Таблица 1. Теглото на тялото се измерва на всеки три дни до края на експеримента. За лечение на хипобарична хипоксия, плъховете са държани в камера с хипобарична хипоксия (Guizhou Fenglei Aeronautics Ordnance Co. Ltd, Китай, модел: DYC-DWI) в продължение на 24 часа при постоянна симулирана надморска височина от 6000 m. Влажността в камерата се поддържаше на 40–50%, а температурата на 22–24 ° C. Плъховете имаха свободен достъп до храна и вода и се поддържаха в 12-часов цикъл светлина-тъмнина. Плъховете се анестезират чрез интраперитонеално инжектиране на пентобарбитал натрий (2%, 1 ml/плъх) и се умъртвяват чрез обезглавяване.

Биохимичен анализ и подготовка на тъканите

За биохимичен анализ на кръвта се вземат проби от кръвта на опашната вена и се прехвърлят в епруветки, съдържащи EDTA. След центрофугиране при 1500 × g в продължение на 15 минути при стайна температура, плазмата се прехвърля в нова епруветка и се съхранява при -80 ° C до употреба. Плазмените нива на общия холестерол и триглицеридите са измерени с помощта на комплект ELISA (E1005 и E1003) от Applygen Technologies Inc. (Пекин, Китай). Плазмените нива на BHB и ацетоацетат (AcAc) се измерват с помощта на комплект ELISA (ab83390 и ab180875), закупен от Abcam (Cambridge, MA). Анализите се извършват съгласно протоколите, предоставени от производителя. След поведенчески тестове плъховете се обезболяват и се жертват чрез обезглавяване. Мозъците бяха бързо отстранени и хипокампусът беше дисектиран и замразен при -80 ° C за бъдещ вестерн блот анализ. Мозъците, използвани за имунохистохимичен анализ, бяха фиксирани в 4% формалдехид веднага след изолирането.

Тест на открито

Плъховете бяха поставени в квадратна открита камера (100 × 100 × 40 см, дължина × ширина × височина) с гладък черен под и черни стени. Подът беше разделен на 25 квадрата по 20 × 20 cm. Плъховете бяха поставени в центъра на камерата и им беше позволено да изследват свободно за пет минути. Поведението им беше записано от цифрова камера, разположена над камерата. Използвайки НЯКОЙ лабиринт софтуер за видео изображения (Stoelting Co., IL), времето, прекарано в централната зона, както и броят на влизанията в централната зона (вътрешни 9 от 25 квадрата) бяха определени. Локомоторното поведение се изчислява като изминатото разстояние по време на теста. Мястото се избърсва със 70% етанол между всеки тест.

Тест за воден лабиринт на Морис

Апаратът за воден лабиринт представляваше кръгъл басейн (диаметър = 160 cm, височина = 50 cm), пълен с вода (температура приблизително 22–24 ° C). Невидима платформа от стиропор беше поставена на 1 см под водната повърхност. Четири визуални сигнала бяха поставени върху завесата (над ръба на басейна), която заобикаляше лабиринта. Басейнът беше разделен на четири квадранта. Поведението се наблюдава и записва от цифров фотоапарат, свързан към компютър, инсталиран с ВСЯКИЯ лабиринт софтуер за видео изображения (Stoelting Co., IL). През петте дни от периода на обучение за придобиване, плъховете бяха поставени във водата към средната точка на всеки от квадрантите. На плъховете им е било позволено да плуват свободно, докато не намерят и се качат на платформата. Ако плъх не успее да намери платформата в рамките на 90 s, той се поставя на платформата за 10 s. Всеки плъх беше подложен на 4 опити на ден и началната позиция се променяше всеки ден. За теста на пространствената сонда платформата беше премахната и плъхът беше поставен във водата на квадрант. Броят на случаите, когато плъхът е преминал предишното местоположение на платформата, времето в целевия квадрант и латентността за първо преминаване на местоположението на платформата в рамките на 90 s са записани.

Western blot анализ

Оцветяване с имунохистохимия (IHC)

За имунохистохимичен анализ, фиксираните мозъци след това се вграждат в парафин съгласно стандартен хистологичен протокол и се разделят. Коронарните участъци (5 μm) на мозъка се инкубират за една нощ с антителата срещу ацетил-хистон Н3 (разреждане 1: 100) и хистон Н4 (разреждане 1:50). След инкубация с биотинилирани кози анти-миши антитела, сигналите се визуализират с помощта на ABC комплект (Vector Lab, Burlingame, CA).

Количествена PCR в реално време (qRT-PCR)

Общата РНК се извлича от хипокампуса на мозъка на мишката, като се използва реактив Trizol (Invitrogen, САЩ). СДНК от първа стойка на всяка проба се синтезира с помощта на комплект за обратна транскрипция MLV (TAKARA, Япония), съгласно инструкциите на производителя. cDNA беше използвана като шаблон за количествена PCR в реално време, използвайки зелена главна смес SYBR (Applied Biosystems, САЩ). Използваните праймери са както следва: BDNF-F: 5ˊ- TGGCTGACACTTTTGAGCAC-3ˊ, BDNF-R: 5ˊ-GAAGTGTACAAGTCCGCGTC-3ˊ; β-актин-F: 5ˊ-TTGCCCTAGACTTCGAGCAA-3ˊ, β-актин-R: 5ˊ- CAGGAAGGAAGGCTGGAAGA-3ˊ. Експресията на гени се нормализира до нивата на иРНК на β-актин.

Хроматин имунопреципитация (ChIP)

Интересните последователности се усилват чрез qRT-PCR метод, използвайки специфични праймери за BDNF промотор I (pI) (pI-F: 5ˊ- GCAGTTGGACAGTCATTGGTAACC -3ˊ; pI-R: 5ˊ- ACGCAAACGCCCTCATTCTG -3ˊ) [15]. PCR реакциите се провеждат в три екземпляра. Цифрите на прага на амплификационния цикъл (Ct) бяха използвани за изчисляване на количествата на IP ДНК като% от входните контроли.

Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен с помощта на GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., Сан Диего, Калифорния) и данните са изразени като средната стойност ± SEM. За данни с еднакви дисперсии е извършен еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от теста на Dunnett.

Резултати

KD повишава плазмените нива на липидите и кетонните тела

Експериментите са проектирани, както е показано на Фигура 1А. След три дни аклимация, плъховете се хранят със STD или KD в продължение на две седмици и след това се подлагат на биохимичен анализ и поведенчески тестове. Първо, ефектите от двете диети върху телесното тегло бяха регистрирани на всеки три дни и установихме, че плъховете, хранени с KD, имат по-бавно наддаване на тегло в сравнение с плъховете в групата със STD (Фигура 1B) След това открихме ефекта от прилагането на KD върху липидния метаболизъм. Както е показано на фигури 1С и 1D, общият холестерол в плъховете KD е малко по-висок от този при плъховете STD, но няма значителна разлика между двете групи. За разлика от това, нивата на триглицеридите при плъховете KD са много по-високи от тези при плъховете STD (p Фиг. 1. Ефектът от лечението с KD върху плазмените нива на липиди и кетони.

A. Схема на експерименталния дизайн. Плъховете се аклиматизират в продължение на 3 дни и след това се разделят на случаен принцип в две групи (n = 20 всяка), хранени или със стандартна диета (STD), или с кетогенна диета (KD). След 14 дни лечение, плъховете бяха подложени на открито тестване и биохимичен анализ. След това плъховете бяха подложени на тест за воден лабиринт на Морис в продължение на 6 дни и лечение на хипобарна хипоксия (10 плъха във всяка третираща група) между 5-ия ден от обучението за придобиване и теста на сондата на 6-ия ден. Б. Теглото на тялото на плъховете се записва през целия експериментален период. Данните са представени като средно ± S.E. C-F. Плазмените нива на общия холестерол (C), триглицеридите (D), BHB (E) и AcAc (F) бяха открити чрез ELISA анализ. Пет плъха във всяка група. Стойностите са представени като средната стойност ± S.E. (** p Фиг. 2. KD лечението подобрява пространственото обучение и паметта при възрастни плъхове.

A. Бяха оценени общото изминато разстояние и броят на влизанията в централната зона в теста на открито. Стойностите са представени като средната стойност ± S.E. (n = 10). Б. Средните стойности на латентните изходи за намиране на скритата платформа в четирите изпитания са показани за петте дни по време на периода на обучение за придобиване. Десет плъха във всяка група.

KD подобрява увреждането на паметта, предизвикано от хипобарична хипоксия

За да се изследва дали лечението с KD може да подобри увреждането на паметта, причинено от хипобарна хипоксия, плъховете бяха преместени в камера за хипоксия (симулирана голяма надморска височина от 6000 m) преди теста за пространствена сонда. След 24 часа излагане, плъховете бяха подложени на сонда тест. Резултатите показаха, че излагането на хипоксия води до очевидно увреждане на паметта, посочено от по-малко пресичания и по-малко време и разстояние, прекарано в целевия квадрант от това на контролната група. Всички тези параметри обаче бяха обърнати чрез лечение с KD (Фигура 3А). В сравнение с плъховете в групата с хипобарна хипоксия, плъховете в групата с KD-хипоксия проявяват засилено предпочитание към целевия квадрант пред другите квадранти (Фигура 3В). Тези резултати показват, че KD проявява очевиден благоприятен ефект върху индуцирано от хипобарична хипоксия увреждане на паметта.

A. Средният брой пресичания на платформата, средното време в целевия квадрант и латентността за първо преминаване на местоположението на оригиналната платформа по време на теста на сондата бяха оценени. Стойностите са представени като средната стойност ± S.E. (n = 10). Б.. Представителни графики за проследяване на движението, показващи общата дължина на пътя по време на теста на сондата. Червеният кръг показва местоположението на платформата.

Екзогенният BHB предотвратява увреждане на пространствената памет, индуцирано от хипобарна хипоксия

За допълнителна проверка дали кетонното тяло, продукт на KD, има директен подобряващ ефект, ние избрахме най-стабилното физиологично кетонно тяло, BHB, за следващия експеримент. За да се имитира ефектът на KD, както е описано по-горе, плъховете бяха предварително третирани с BHB (в доза от 200 mg/kg/ден) в продължение на 2 седмици и след това бяха подложени на тест за воден лабиринт на Morris. Тъй като интраперитонеалната инжекция ще позволи на веществата да се абсорбират с по-бавна скорост, а интраперитонеалната инжекция ще доведе до незначителен ефект по време на поведенчески тестове [16], използвахме интраперитонеалната инжекция на BHB, която е приложена в публикувани доклади [17, 18]. Въпреки че плъховете в контролната и BHB групите се научиха да намират платформата със същия модел по време на 5-дневно обучение за придобиване (Фиг. 4B), BHB може значително да подобри увреждането на паметта, индуцирано от хипобарна хипоксия, представено от повече пресичащи числа, повече време в целевия квадрант и намалена латентност към първото влизане в платформата в сравнение с лечението само на хипобарна хипоксия (Фигура 4C – 4F). Тези резултати демонстрираха, че BHB има директен подобряващ паметта ефект и служи като основен изпълнител на полезните ефекти на KD.

A. Плазмените нива на BHB са открити чрез ELISA анализ. Пет плъха във всяка група. Стойностите са представени като средната стойност ± S.E. (** p Фиг. 5. Лечението с KD увеличава ацетилирането на хистона в хипокампуса.

Нивата на протеин на ацетил-хистон H3 (K9/K14), ацетил-хистон H3 (K14) и ацетил-хистон H4 (K12) в хипокампуса бяха открити чрез Western blot. Нивата на β-актин служат като вътрешен контрол. Три плъха във всяка група. Дясната стълбовидна диаграма показва относителната плътност на лентата на всеки протеин във всяка група, а данните са показани като средните стойности ± S. (** p Фиг. 6. Лечението с KD увеличава ацетилирането на хистона в CA1 областта на хипокампуса.

Представителни изображения на имунохистохимичен анализ на ацетил-хистон H3 (K9/K14) и ацетил-хистон H4 (K12) в CA1 региона на хипокампуса. Вложките показват по-голямо увеличение на представителните области, разположени в пунктираната кутия.

KD активира PKA/CREB сигнализиране в хипокампуса