• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • Запис на ORCID за Олег Гусев
  • За кореспонденция: kikawada @ affrc.go.jpoleg.gusev @ riken.jp

Редактирано от Дейвид Л. Денлингер, Държавният университет в Охайо, Колумб, Охайо, и одобрено на 6 юли 2020 г. (получено за преглед на 27 февруари 2020 г.)

анализ

Значимост

Анхидробиозата е обратимо метаболитно състояние, което възниква в отговор на тежко изсушаване. Най-голямото известно анхидробиотично животно е ларвата на африканския хирономид Polypedilum vanderplanki. Тук изследвахме как се променя метаболизмът на ларвите по време на цикъла на изсушаване-рехидратация и как простите биохимични процеси определят жизнеспособността на хирономида. Основни открития показват, че в допълнение към известната си роля на анхидропротектор, трехалозата действа като основен източник на енергия за рехидратация. Цитратът и аденозин монофосфатът, натрупани в сухо състояние, позволяват бързо възобновяване на метаболизма по време на фазата на възстановяване. И накрая, метаболитните отпадъци се съхраняват като стабилни или нетоксични съединения като алантоин, ксантурена киселина или очна киселина, които също могат да действат като антиоксиданти.

Резюме

Въпреки значителните познания за транскрипционната активност, свързана с анхидробиозата, малко се знае за свързаните неензимни биохимични процеси и метаболитни смущения. В крайните етапи на изсушаване и началните етапи на рехидратация не може да има ензимна активност (тъй като нивото на водата е изключително ниско) и следователно хомеостазата и клетъчната структура трябва да се поддържат от малки молекули. Въпреки че несъмнено е необходима генна регулация извън тази критична фаза, простите биохимични и биофизични процеси трябва да преобладават в силно дехидратиран „спящ“ организъм.

Предполагаме, че или при подготовка, или за възстановяване от сухо състояние, оцеляването на ларвите до голяма степен се определя от такива неензимни химични реакции. В това проучване ние изследвахме ефекта от процеса на изсушаване-рехидратация върху съдържанието и пропорциите на метаболитите в ларвите на P. vanderplanki. Основните ни открития показват, че 1) трехалозата действа като основен източник на енергия, поддържаща възстановяването на рехидратиращи ларви, 2) натрупаният цитрат и аденозин монофосфат (AMP) улесняват бързото възстановяване на енергийния метаболизъм след рехидратация и 3) натрупването на токсични отпадъци метаболитите се избягват чрез производство на инертни аналози или потенциално антиоксидантни съединения.

Резултати и дискусия

Общи наблюдения.

Метаболитно профилиране на ларвите на P. vanderplanki разкри 266 метаболита (124 метаболита в катионен режим и 142 метаболита в анионен режим) в трите тествани физиологични състояния: хидратирани (D0), изсушени (D48) и рехидратирани (R3). Пълен списък на откритите метаболити е наличен в Dataset S1 със съответните относителни пикови области и абсолютна количествена оценка за някои от тях. В допълнение към този повторен анализ на три основни физиологични състояния, анализ на еднократен курс също беше извършен по време на процесите на десикация и рехидратация на ларвите на P. vanderplanki, в сравнение със смъртоносния курс на десикация при родните чувствителни към десикация видове P. nubifer (Набор от данни S2). Според базата данни на човешкия метаболом 4.0 (https://hmdb.ca/) йерархична класификация (приложение SI, фиг. S1), повечето от метаболитите, идентифицирани в основния повторен анализ, попадат в „органични киселини и производни“ и „нуклеозиди, нуклеотиди и аналози “.

Анализът на основните компоненти (PCA) е използван за определяне на променливостта в промените в съдържанието на метаболит по време на цикъла на десикация-рехидратация в P. vanderplanki. PCA показа голямо разпространение между трите физиологични състояния, с добро съгласие между трите повторения на всяко състояние (фиг. 1А). Общо първите два основни компонента представляват 77% от общата променливост. PC1 (43,9%) обяснява общата посока в динамиката на концентрацията на метаболитите между непокътнати хидратирани ларви и ларви в анхидробиотичния цикъл (изсушаване-рехидратация), докато PC2 (33,1%) отчита разминаването между сухия и рехидратирания стадии.

Резултати от PCA. (A) PCA парцел. Три повторения за всяко физиологично състояние са показани като точки в различни цветове (виж ключа). PC1 представлява 43,9% от променливите и обяснява промените в съдържанието на метаболити по време на анхидробиоза; PC2 представлява 33,1% от променливите и показва разликата между метаболомите на изсъхнали и рехидратирани ларви. (Б) График за натоварване на фактора. Метаболитите са маркирани с точки. Прекъснатите линии представляват прагови стойности (0,0 за РС1, 0,05 и -0,05 за РС2), използвани за класифициране на метаболитните групи според тяхната реакция към стадия на анхидробиоза (модел на промяна в съдържанието на този метаболит). Групи метаболити с различни модели на експресия са маркирани с различни цветове (виж ключа), включително ANOVA незначителни метаболити. (C) Линейни графики, представящи средния модел на промяна в съдържанието на метаболит за групи с различна реакция, избрани чрез натоварване с фактор. Лентите за грешки показват SE на средна стойност; цигулките отразяват разпределението на нормализираните количества метаболити. Таблиците по-долу изброяват метаболитите във всяка група с 10-те най-високи натоварвания.

Натоварванията с PCA разкриват, че метаболитите с високи положителни стойности на PC1 демонстрират значително увеличение на концентрацията по време на поне един от етапите на анхидробиоза (фиг. 1В). Различията в натоварванията с PC2 позволяват да се идентифицират три основни модела на промяна в съдържанието на метаболит: 1) натрупване по време на изсушаване, 2) натрупване по време на рехидратация и 3) натрупване по време на двата етапа на анхидробиоза. За всяка от тези групи беше определен среден модел на промяна (фиг. 1В). Показани са и метаболитите с 10-те най-големи натоварвания за всяка група; те вероятно ще бъдат важни за дискриминация между групите. Сред тях са трехалоза-6-фосфат (Т6Р), предшественик на съединение (т.е. трехалоза) с известни анхидропротективни свойства; междинни продукти на пътя на глутатиона (GSH) (гама-аминомаслена киселина, гама-глутамилцистеин и очна киселина); невроактивни междинни продукти по пътя на разграждането на триптофана (кинуренин [KYN] и кинуренова киселина [KA]); и AMP, чието натрупване е типично за ларвите на P. vanderplanki по време на анхидробиоза.

Роля на трехалозата в анхидробиозата: оптимален енергиен ресурс за бързо възстановяване на метаболизма.

Метаболитното профилиране на ларвите на P. vanderplanki разкрива значителни смущения в нивата на различни междинни въглехидратни продукти (фиг. 2). В метаболома на изсъхналите ларви, предшественикът на биосинтеза на трехалоза, T6P, е единствената захар, чието ниво се увеличава (47 пъти в сравнение с хидратираните ларви). Както беше посочено по-горе, трехалозата притежава редица анхидропротекторни свойства (12 ⇓ –14) и натрупването на този дизахарид също е определено като основен определящ фактор за толерантността към изсушаване при ларвите на P. vanderplanki (11).

Трехалазата е ензимът, който превръща трехалозата в глюкоза. Изненадващо, в последния етап на десикация, нивото на РНК на трехалаза (mRNA) претърпява драстично повишение, може би, така че производството на трехалазен протеин може да започне веднага след повторно излагане на вода, като по този начин позволява бързо производство на глюкоза. Това е в допълнение към трехалазния протеин, който вече се намира в сухи ларви в неактивна форма, който се активира след рехидратация (15). Важно е да се подчертае, че с напредването на ларвите чрез анхидробиоза, механизмите за транскрипция и транслация стават напълно дехидратирани и следователно престават да функционират. По този начин предполагаме, че експресията на трехалазния ген, който позволява натрупване на съответната иРНК в сухи ларви, е уникална стратегия за адаптация за осигуряване на бърз пострехидратационен катаболизъм на трехалоза, докато точните транслационни или транскрипционни механизми, чрез които нежеланата трехалазна активност се блокира при дехидратиране остават да се разберат ларви.

В рехидратираните ларви съдържанието на G6P се е увеличило 48 пъти в сравнение с изсъхналите ларви (фиг. 2А и приложение SI, фиг. S2). Това явление може да се дължи на действието на трехалаза. G6P свързва няколко важни въглехидратни пътища, включително гликолиза, пентозофосфатен път (PPP) и производството на други захари. PPP активирането участва в цитопротекцията, където ограничава окислителните щети, като осигурява намален NADPH. Увеличаването на генерирането на реактивни кислородни видове (ROS) бързо превключва потока на G6P в PPP (18). Подобно шунтиране на глюкоза като PPP също намалява окислителните щети при ястребите, хранещи се с нектар (19). Тъй като започва рехидратацията в ларвите на P. vanderplanki, активността на TPS пада, което позволява на G6P да подхранва PPP, а не гликолиза, така че NADPH се връща към контролните нива (фиг. 2), вероятно повишавайки антиоксидантния потенциал на рехидратираните ларви.

За да илюстрираме ролята на трехалазата и да проверим връзката между разграждането на трехалозата и повишаването на антиоксидантния потенциал чрез PPP активиране, извършихме експерименти за рехидратация с ларви, третирани с инхибитор на трехалаза, валидоксиламин А (VAA). В сравнение с контролно инжектираните контроли, инжектираните с VAA ларви, които бяха дехидратирани и след това оценени 16 часа след рехидратацията, показаха нарушено възстановяване, като близо 80% от ларвите бяха рехидратирани, но неподвижни (фиг. 3С). Всички неподвижни ларви загинаха в рамките на 48 часа след рехидратацията. Този резултат показва, че активното разграждане на трехалозата след рехидратация е необходимо за оцеляването на ларвите. Въпреки че лечението с VAA ограничава натрупването на трехалоза в сухи ларви, вероятно поради намеса от странични ефекти с ензимите, синтезиращи трехалоза, то ефективно инхибира разграждането на трехалозата след рехидратация, както се очаква (приложение SI, фиг. S3). Общият антиоксидантен потенциал беше изследван при контролни и третирани с VAA ларви (SI Приложение, Фиг. S4), но поради страничния ефект на VAA върху натрупването на трехалоза в сухи ларви не беше възможно ясно да се потвърди или опровергае ролята на разграждането на трехалозата при толерантност към оксидативен стрес при ларви след рехидратация.

Тъй като се очаква инхибирането на трехалазата от VAA да блокира мобилизирането на основния източник на въглехидрати в рехидратирани ларви (фиг. 3А и приложение SI, фиг. S3), смъртта на третираните с VAA ларви след рехидратация може до голяма степен да се обясни с увреждането на гликолизата и следователно на доставката на енергия (фиг. 3В). За да проверим тази хипотеза, ние съборихме експресията на гена на трехалаза чрез РНК интерференция (RNAi) в Pv11, устойчива на изсушаване клетъчна линия от P. vanderplanki (SI Приложение, Фиг. S5). Въпреки че нокдаунът на трехалаза не повлиява жизнеспособността на Pv11 клетките веднага след рехидратацията (SI Приложение, Фиг. S6A), последващият клетъчен растеж е значително инхибиран от лечението (SI Приложение, Фиг. S6B). Тъй като клетките Pv11 се отглеждат в среда, богата на захари (захароза, малтоза, d -глюкоза и др.), Намаленият поток през гликолитичния път не може да обясни тази разлика в клетъчния растеж. По този начин, друг метаболитен ефект, който зависи от разграждането на трехалозата, трябва да бъде отговорен за инхибирането на клетъчния растеж в третирани с трехалаза RNAi клетки Pv11.

За да обобщим, чрез метаболомен анализ и поредица от експерименти in vivo и in vitro, ние показахме все още не напълно проучена роля на трехалозата като критичен източник на енергия за оцеляване на ларвите по време на рехидратация. Не само натрупването на трехалоза е необходимо за образуване на защитна стъклена матрица в сухо състояние, но нейното бързо разграждане след рехидратация, което е от съществено значение за оцеляването, насърчава гликолизата и генерирането на енергия, както и активиране на ПРЗ, което вероятно намалява дължимите щети до оксидативен стрес.

Цикъл на лимонена киселина и енергиен метаболизъм: Адаптивно бързо рестартиране при рехидратация.

Цикълът на лимонената киселина (CAC) или цикълът на Krebs е циклична поредица от ензимни реакции във всички аеробни организми, която генерира енергия под формата на аденозин трифосфат (АТФ) (20, 21). Първият продукт на CAC е лимонената киселина, която действа като централна връзка за много метаболитни пътища и контролира енергийното ниво в клетките. Когато е в излишък, лимонената киселина инхибира гликолизата, стимулира глюконеогенезата и възпрепятства реакциите на САС надолу по веригата (22).

По време на изсушаването на ларвите на P. vanderplanki (фиг. 4), всички междинни продукти на САС показват значително намалени нива, с изключение на цитрат и цис-аконитат, които и двете удвояват съдържанието си. Натрупването на лимонена киселина може да има двойно въздействие в зависимост от стадия на анхидробиоза. По време на изсушаването може да действа като аварийна спирачка за забавяне на метаболизма на ларвите по време на „спящия“ период. Въпреки това, натрупването на цитрат също може да бъде от полза за оцеляването при суша. Например лимонената киселина може да съществува в безводна (безводна) форма и има свойства на хелатиращ агент и различни антиоксидантни и антикоагулантни ефекти (23 ⇓ –25). По време на рехидратацията митохондриалните запаси от цитрат вероятно ще позволят относително бързо рестартиране на CAC функцията и енергийния метаболизъм без въвеждане на въглехидрати от гликолиза в цитоплазмата.