Отделение за хранителни науки и токсикология, аспирантура по метаболитна биология, Калифорнийски университет, Бъркли, Калифорния, Съединени американски щати

подобрява

Отделение за хранителни науки и токсикология, аспирантура по метаболитна биология, Калифорнийски университет, Бъркли, Калифорния, Съединени американски щати

Отделение за хранителни науки и токсикология, аспирантура по метаболитна биология, Калифорнийски университет, Бъркли, Калифорния, Съединени американски щати

Отделение за хранителни науки и токсикология, аспирантура по метаболитна биология, Калифорнийски университет, Бъркли, Калифорния, Съединени американски щати

Отделение за хранителни науки и токсикология, аспирантура по метаболитна биология, Калифорнийски университет, Бъркли, Калифорния, Съединени американски щати

Отделение за хранителни науки и токсикология, аспирантура по метаболитна биология, Калифорнийски университет, Бъркли, Калифорния, Съединени американски щати

  • Ростислав Чудновски,
  • Ерлия Томпсън,
  • Кевин Тарп,
  • Марк Хеллерщайн,
  • Джоузеф Л. Наполи,
  • Андреас Щал

Фигури

Резюме

Цитат: Chudnovskiy R, Thompson A, Tharp K, Hellerstein M, Napoli JL, Stahl A (2014) Консумацията на изяснен сок от грейпфрут подобрява инсулиновата резистентност и повишаване на теглото при мишки с високо съдържание на мазнини. PLoS ONE 9 (10): e108408. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0108408

Редактор: Макото Макишима, Медицинско училище в Университет Нихон, Япония

Получено: 6 ноември 2013 г .; Прието: 20 август 2014 г .; Публикувано: 8 октомври 2014 г.

Финансиране: Кооперацията за отглеждане на грейпфрут в Калифорния предостави финансова подкрепа за този проект. Финансистът няма роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. Никой от авторите няма финансови или нефинансови конкурентни интереси, които да разкрие.

Конкуриращи се интереси: Кооперацията за отглеждане на грейпфрут в Калифорния предостави финансова подкрепа за този проект. Това не променя придържането на авторите към всички политики PLOS ONE за споделяне на данни и материали и не повлиява на резултата от тези експерименти.

Въведение

Неотслабващото нарастване на честотата на затлъстяването и свързаните със затлъстяването нарушения, особено диабет тип 2, продължава да представлява монументални предизвикателства за здравето [1]. Промените в диетата, включително използването на неутрализирани лекарства, предлагат обещаващи подходи за подобряване на затлъстяването и неговите ефекти и за увеличаване на здравословното състояние. Сокът от грейпфрут (GFJ) е относително богат на хранителни вещества, включително витамини и минерали, и има по-малко калории в сравнение с други много сокове [2], [3]. Популяризирани са ефектът от грейпфрут или GFJ, стимулиращ здравето и отслабването, но най-вече в контекста на хипокалорична диета, напр. „холивудската диета“, която ограничава приема на калории до 3349 kJ на ден. Относително малко проучвания при хора са изследвали ефектите на консумацията на грейпфрут или GFJ върху метаболизма в добре контролирани експерименти и те са дали интригуващи, но противоречиви резултати. Fujioka и сътр. съобщава, че консумацията на GFJ, цял грейпфрут или „хапчета от грейпфрут“ води до загуба на тегло и подобрена чувствителност към инсулин [4]. За разлика от него, Silver et al. съобщава, че консумацията на грейпфрут или GFJ няма значителни ефекти върху метаболитните променливи, с изключение на умерено увеличение на HDL, при затлъстели участници, хранени с ограничена калорична диета [5].

Изследванията върху животни са използвали GFJ, прилаган ad libitum, или са се фокусирали върху един биоактивен компонент, като флавоноидния нарингин, който допринася за горчивия вкус на GFJ, или върху неговия агликон, нарингенин. Тези проучвания не разглеждат разликите в консумацията на вода между обработваните и контролните групи и дават различни резултати. Мишките са неблагоприятни за горчивия вкус на GFJ и нарингин, което може да причини дехидратация, нежелание за ядене и загуба на тегло, независимо от метаболитните ефекти. Например, Jung et al. съобщава, че добавеният към храната нарингин намалява кръвната захар при db/db мишки, но няма ефект върху телесното тегло [6]. Kannappan и Anuradha съобщават, че нарингинът влияе върху хранителния и енергийния метаболизъм, както и върху инсулиновата чувствителност [7]. Pu et al. съобщава, че добавянето нарингин към питейната вода на мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини (HFD) води до загуба на тегло, намаляване на кръвната глюкоза и подобрена чувствителност към инсулин [8]. Изследвания, фокусирани единствено върху нарингин, пренебрегват сложния фитохимичен състав на GFJ с много потенциални нутрицевтични съединения, включително бергамотин - инхибитор на цитохром Р450 с потенциални антитуморни ефекти.

Други изследвания са фокусирани върху GFJ и/или взаимодействията нарингин-лекарство [10], [11]. Нарингин е идентифициран като инхибитор на Cyp3A4 и органичен анионен транспортен протеин, които медиират съответно катаболизма на лекарствата и износа на ентероцити. Комбинираните ефекти на тези две са разкрити като механизъм, чрез който GFJ може да промени чревния клирънс на първо преминаване на различни лекарства, като статини [10], [12].

Ние докладваме модел, при който мишките консумират чрез центрофугиране изяснен GFJ (cGFJ) ad libitum при скорости, сравними с консумацията на течности от контролните групи. Консумацията на cGFJ не променя приема или абсорбцията на храна. При мишки, хранени с HFD, cGFJ намалява скоростта на наддаване на тегло, натрупване на чернодробен триацилглицерол и кръвна глюкоза на гладно и подобрява инсулиновата чувствителност. При мишки, хранени с LFD, консумацията на cGFJ води до двукратно намаляване на инсулина на гладно. Тези данни разчитат на добре контролиран животински модел, за да разкрият, че консумацията на GFJ има подобряващи здравето ефекти и тези ефекти се медиират от съединения в допълнение към нарингин.

Материали и методи

Подготовка на GFJ

GFJ беше изцеден от пресен калифорнийски рубиненочервен грейпфрут, предоставен от Калифорнийската кооперация за отглеждане на грейпфрут, центрофугиран при 10 400 × g в продължение на 10 минути при 4 ° C за отстраняване на пулпа, изменен с 0,15% захарин (w/v), разделен на аликвотни части от 25 ml и се съхранява при -20 ° C [13], [14]. РН на този избистрен препарат (cGFJ) е 3,5, в сравнение с 5,5 за подсладената вода, използвана като контрол. Установихме, че калоричното съдържание на cGFJ е 1335 J/ml чрез бомба калориметрия на лиофилизирана проба, както беше описано по-рано [15]. Контролните мишки получават вода с 4% глюкоза (w/v) и 0,15% захарин (наричана по-нататък контролна или контролна вода), така че всички групи консумират изокалорични течности със същото количество захарин.

Животни и диети

Процедурите бяха одобрени от Университета на Калифорния-Бъркли Комитет за грижи и употреба на животните и бяха направени в съответствие с указанията на AAALAC. Четири седмици мъжки мишки C57BL/6J са закупени от Jackson Laboratories (каталог № 000664). Мишките бяха настанени индивидуално и бяха хранени с пречистени диети при пристигане (освен ако не е посочено друго) с 10% мазнини (LFD) (Research Diets Cat. # D12450B) или 60% мазнини (HFD) (Research Diets Cat. # D12492). Всеки стрес, предизвикан от изолиране на мишки в изолация, се нормализира чрез еквивалентно и едновременно третиране на мишки във всеки експеримент.

Мишките се претеглят три пъти седмично. Консумацията на храна се наблюдава два пъти седмично. Мишките бяха разделени на случаен принцип в групи от шест (освен ако не е отбелязано друго): контроли (вода с 4% глюкоза и 0,15% захарин); 50% cGFJ (50% cGFJ/вода с 0,15% захарин); 25% cGFJ (25% cGFJ/вода с 4% глюкоза и 0,15% захарин); нарингин (0,72 mg/ден във вода с 4% глюкоза и 0,15% захарин); метформин (7,5 mg/ден метформин с 4% глюкоза и 0,15% захарин); метформин + cGFJ (7,5 mg/ден метформин с 0,15% захарин в 50% cGFJ). Течностите се дават в обемни бутилки (Med Associates, cat # PHM-127-15) за количествено определяне на консумацията и се заменят ежедневно.

Кръвна захар

Глюкозата е измерена в понеделник, сряда и петък между 9 и 11 часа сутринта с монитор за кръвна захар NovaMax в кръвта от убождане на опашката (AmericanDiabetesWholesale). Стойностите на глюкомера бяха коригирани с помощта на комплект за ензимен анализ на глюкоза (Sigma, cat # GAHK20-1KT).

Тестове за толерантност към глюкоза (GTT), инсулин (ITT) и пируват (PTT)

За GTT мишките се гладуват цяла нощ и се инжектират i.p. с 0,2 ml глюкоза в стерилна вода за доставяне на 2 g/kg глюкоза. За ITT, мишките се гладуват 4 часа и се инжектират i.p. с 0,75 единици инсулин/кг. За РТТ, мишките се гладуват цяла нощ и се инжектират i.p. с 0,2 ml пируват в стерилен PBS за доставяне на 2 g/kg.

Инсулин ELISA

Концентрациите на инсулин се определят с инсулинов комплект ELISA от висок обхват (ALPCO cat # 80-INSMSH-E01, E10) в кръв, взета ретро-орбитално след пост през нощта. На мишките беше разрешен достъп до храна 4 часа и бяха взети повторни проби.

Концентрации на белтъци и триацилглицерол (TG) на лизати на органи

Концентрациите на протеини бяха изследвани с BCA комплект за анализ на протеин (Thermo Scientific cat # 23227). Концентрациите на TG бяха анализирани с комплекта Infinity TG (Thermo Scientific cat # TR2241).

Имунохистохимия

Черният дроб се фиксира 1 час при 4 ° C с 4% параформалдахид и се инкубира през нощта при 4 ° C с криоконсервираща среда от 30% захароза, 20% среда за оптимална температура на рязане (VWR cat # 25608-930) и 50% Superblock състоящ се от блок плюс 2% нормален магарешки серум. Блокът се състоеше от 50 ml 10 × балансиран солев разтвор на Hanks, 50 ml фетален телешки серум, 5 g говежди серумен албумин и 0,25 g сапонин в 500 ml. Блоковете бяха разделени на 8 µm ленти при -23 ° C. Секциите се оцветяват 1 час при стайна температура с неполярна BODIPY сонда (Molecular Probes cat # D-3922). Слайдовете бяха монтирани с DAPI/глицеролова среда за монтиране (Life Technologies cat # S36938) и се съхраняват при -20 ° C до получаване на изображения.

PCR в реално време

PCR в реално време се извършва с помощта на TaqMan Universal Master Mix II (Applied Biosystems). Грундовете са закупени от Integrated DNA Technologies (Таблица 1).

Уестърн блотинг

Черният дроб се хомогенизира с Polytron PT2100 в радио-имунопреципитационен лизисен буфер, съдържащ протеаза и фосфатазни инхибитори (Sigma cat # P8340 и cat # P5726) и се центрофугира 5 минути при 3220 × g. Протеин (50 ug) се зарежда върху 4–20% Tris-глицинов гел. Антителата са закупени от Cell Signaling. Сигналите се определят количествено със система за анализ на гел LI-COR Odyssey и се нормализират до β-тубулин.

Анализи на абсорбция

На 4-седмична възраст мишките (7 на група) са хранени с HFD в продължение на 2 седмици, докато пият 50% cGFJ или контролират водата ad libitum. Мишките са гладували цяла нощ и са дадени със 740 kBq [14 C] олеат в 200 µL зехтин или 740 kBq [3 H] 2-дезокси-D-глюкоза в 200 µl стерилен PBS, съдържащ 2,5 g/kg глюкоза, или 740 kBq [ 14 С] таурохолова киселина в 500 цМ таурохолова киселина в стерилна вода. Кръвта беше взета ретро-орбитално 15, 60, 120, 180 и 240 минути след дозиране. Радиоактивността беше измерена в 10 uL серум.

Непряка калориметрия

Мишките се изследват индивидуално чрез индиректна калориметрия (Columbus Instruments, Columbus Ohio, САЩ) по време на гладуване или след гладуване 7 часа и повторно хранене на 1,1 g от HFD, последвано от гладуване за една нощ. Експерименталните анализи бяха започнати между 15 и 16 часа и продължиха около 23 часа. Активността се наблюдава на интервали от 10 минути.

Концентрации и синтез на мастни киселини

Общите концентрации на FA в черния дроб (C16: 0, C16: 1, C18: 0, C18: 1 и C18: 2) се определят чрез газова хроматография и откриване на пламъчна йонизация [15]. Синтезът на палмитат се измерва чрез анализ на включването на стабилен изотоп. На ден 0 мишките се инжектират i.p. със 100% D2O (Sigma cat # 151890), съдържащ 0,9% NaCl (0,35 ml/g телесно тегло). На мишките се дават 8% D2O в техните питейни разтвори за 17 дни. Включването на деутерий в серума и черния дроб се определя чрез GC/MS анализ [16] - [18]. Синтезът на палмитат се изчислява като фракция от новосинтезиран палмитат × общо mg палмитат.

Статистика

Извършен е статистически анализ, както е описано в легендите на фигурите. Данните са средно ± SE. Статистическата значимост се определя чрез двустранни, несдвоени t-тестове.

Резултати

Изокалорично приложение на cGFJ

Въз основа на средната дневна консумация на течност, мишките са били неблагоприятни за пиене на неподсладен 100% cGFJ, подсладен 100% cGFJ или захарин/цикламат подсладен 50% cGFJ/вода (v/v) (Фиг. 1A-C). За разлика от това, консумацията на cGFJ е сравнима с консумацията на течност от контролната група, когато на мишките се дава 50% GFJ, подсладени с 0,15% захарин (фиг. 1D).

Мишките получават 100% cGFJ, 100% cGFJ + 0,15% захарин, 50% cGFJ + 0,15% захарин + 1,5% цикламат или 50% cGFJ + 0,15% захарин като техните единствени течности: A) консумация на течност, *** P = 0,0007; Б) разход на течност, *** Р 0,6. Статистическата значимост се определя чрез двустранни, несдвоени t-тестове.

Въздействие на GFJ върху консумацията, усвояването и енергийните разходи

Мишките бяха хранени или с LFD, или с HFD за 100 d с достъп до „контролна вода“ (вж. Материали и методи) или 50% cGFJ като единствените им източници на течности. Приемът на cGFJ не повлиява среднодневната консумация на храна, нито кумулативната консумация по време на LFD (Фиг. 2А, В). Общата течност, консумирана от мишки, хранени с LFD, е 141 ± 1,1 ml вода срещу 135 ± 0,5 ml 50% cGFJ (P 0,05). Не се наблюдават разлики в теглото между GFJ и контрола (Фиг. 2C). В съответствие с подобни тегла не се наблюдават разлики в епидидималните мастни накладки за мишки, хранени с LFD (фиг. 2D).

Мишките се хранят с LFD или HFD и 50% cGFJ в продължение на 100 дни, започвайки от отбиването (ден 0) на възраст 4 седмици. LFD: A) кумулативна консумация на течност; Б) кумулативна консумация на храна; В) общо телесно тегло; Г) интраабдоминално мастно тегло. HFD: E) кумулативна консумация на течност; Е) кумулативна консумация на храна, * Р 0,7 и фекално тегло на мишки, събрани в продължение на 24 часа в края на 106 дни от лечението, Р> 0,03 за GFJ. За определяне на статистическа значимост беше използван двустранен, несдвоен t-тест.

Приемът на cGFJ също не повлиява средния дневен, нито кумулативния разход на течности и храна по време на хранене с HFD (Фиг. 2E, F). Групата с 50% GFJ консумира 137 ± 0,5 ml спрямо 140 ± 2,2 ml чрез контроли (P> 0,05). Кумулативната консумация на храна е 5580 ± 193 kJ за групата на GFJ срещу 5684 ± 155 kJ за контролите (P> 0,05). За разлика от мишките, хранени с LFD, мишките, хранени с HFD с достъп до 50% GFJ, тежат с 18,4% по-малко от контролите в края на 100 d: 31,4 ± 0,7 g срещу 38,5 ± 2,8 g, P 3 H] глюкоза, [14 С] олеинова киселина или [14 С] таурохолова киселина не се различават между cGFJ и контролите по време на 240-минутен анализ (данните не са показани).

Непряката калориметрия на гладни мишки не показва значителни разлики в 24-часовия енергиен разход (VO2 и VCO2), използването на субстрата (съотношение на дихателен обмен), производството на топлина или активността между HFD-захранваните GFJ и контролните групи (данните не са показани).

cGFJ подобрява метаболитните променливи

В края на изследването с LFD не се наблюдава значителна разлика в нивата на кръвната захар на гладно между cGFJ групата и контролата (фиг. 3А). В хранено състояние, cGFJ няма ефект върху серумните нива на инсулин при мишки, хранени с LFD (данните не са показани). cGFJ не доведе до значителни разлики в GTT или ITT нито по едно и също време (данните не са показани). Дори и без предизвикателство с високо съдържание на мазнини, обаче, нивата на серумния инсулин на гладно са 2 пъти по-ниски в cGFJ спрямо контролната група, хранена с LFD (фиг. 3В).

Мишките бяха третирани, както е описано в легендата на фиг. 2. A, B) стойности в края на 100 d LFD: A, кръвна глюкоза на гладно; B) серумен инсулин на гладно, * P Фигура 4. Въздействие на cGFJ върху активността на AKT в черния дроб и скелетните мускули, съдържанието на TG и синтеза на мастни киселини.

Мишките са хранени с HFD и 50% cGFJ за 100 d, както е описано в легендата на фиг. 2. А) съотношения pAKT/общо AKT в мускулите (*** P = 0,0002) и черния дроб (* P Фигура 5. Въздействие на cGFJ при установено диетично затлъстяване.

Мишките бяха хранени с HFD за 6 седмици, започвайки от 4 седмици. След това животните бяха разделени на случаен принцип в контролни и GFJ групи (ден 0) и храненето с HFD беше продължено допълнително 56 d: A) кумулативна консумация на течност; Б) кумулативна консумация на храна; В) общо телесно тегло; Г) кръвна глюкоза; E) GTT и AUC на седмица 6, P Фигура 6. Сравнение на метаболитните ефекти на cGFJ, нарингин и метформин.

На мишки, хранени с HFD, се дава cGFJ, вода, съдържаща нарингин или метформин, или контролна вода за 106 d: А) кумулативна консумация на течност и скорости, базирани на линейна регресия. Наклоните не се различават съществено; Б) кумулативна консумация на храна и норми, базирани на линейна регресия. Наклоните не се различават съществено; В) общо телесно тегло. Двупътният ANOVA с Bonferroni посттестове показа, че лечението и времето имат значителен ефект (p Фигура 7. Ефекти на cGFJ върху нивата на серумна глюкоза и върху фосфорилирането на AMPK и ACC в мускулите и черния дроб.

Мишките бяха хранени с HFD. А) Нива на кръвната глюкоза по време на 17-дневен достъп до 50% cGFJ, 25% cGFJ, метформин, метформин и 50% cGFJ или вода. B-E) На мишките беше разрешен достъп до 50% GFJ, нарингин или метформин в контролна вода за 106 d, започвайки от отбиването: B) pAMPK на черния дроб/AMPK, * P Фигура 8. Промени в генната експресия, причинени от cGFJ.