В следващите примери и, освен ако не е посочено друго, пропорциите са посочени в тегловни проценти.

средство

Демонстрация на стимулиращата активност на фитосфингозин върху производството на лептин от миши адипоцити в култура.

1. Принцип на теста

Концепцията, според която мастната маса може да се регулира чрез секретирани циркулиращи фактори, е много интересна.

Принципът на теста е да се контролира секрецията на лептин от адипоцитите.

2. Материал и методи

Култура на 3T3 F442A клетки

Клон, който има способността да натрупва по-големи количества триглицериди, беше изолиран от установена клетъчна линия на миши 3T3 преадипоцити. Липолитичните агенти намаляват това натрупване. Поради това изглежда важно да се тестват потенциални липолитични агенти на тази клетъчна линия на миши преадипоцити 3T3 F442A. Тези преадипоцити (GREEN H. и KEHINDE O. - Спонтанни наследствени промени, водещи до повишена мастна конверсия в клетки 3T3, Cell Vol. 7, 105-113, 1976) могат да се размножават и диференцират, като притежават морфологичния и биохимичния фенотип, който е характерен за диференцирана функция на зрелия адипоцит. Когато са във фаза на експоненциален растеж, те са с фибробластичен вид, имат удължена форма и са много прилепнали към опората. При вливането, когато условията позволяват това, много преждевременният морфологичен преход им придава заоблена форма.

По този начин клетките се подлагат на процес на клонна амплификация. Към тези морфологични промени се добавя повишаване на активността на липогенетичните ензими, както и увеличаване на реакциите на клетките към хормони/фактори, които влияят на липогенезата и липолизата.

По този начин преадипоцитите 3T3 F442A представляват отличен модел за изследване на липолиза, благодарение на морфологичните и метаболитни трансформации, придобити от клетките по време на тяхната програма за развитие. (Pairault J и Lasnier F: Контрол на адипогенетична диференциация на 3T3 F442A клетки чрез ретиноева киселина, дексаметазон и инсулин: топографски анализ J. cell Physiol. 1987, 132, 279-86).

Според литературата лептинът се секретира в хранителната среда, тъй като се съхранява в адипоцитите. (Wabitsch M et al, Diabetes, 1996, том 45, Bornstein S. et al, Diabetes, 2000, том 49, Friedman J M, Nutrition Reviews, 1998, том 56 n ° 2).

В 3T3 F442A клетки е изследвана по-специално експресията на гена ob (Leroy P et al, J. от Biol. Chem., 1996, том 271 n ° 5, стр. 2365-2368, Considine RV et al, - Horm. Res. 1996, 46: 249-256).

Преадипоцитите на 3T3 F442A са показани при D0 в 35 mm чашки на Петри (Corning) и поставени в пещ при 37 ° С под атмосфера въздух-CO2 (95-5). Клетките се култивират в минимална съществена среда Eagle, модифицирана съгласно Dulbecco (глюкоза 4.50 g/l) (DMEM-GIBCO BRL), допълнена с 5% телешки серум (CS) (BIOMEDIA®) и 5% фетален телешки серум (GIBCO) ) по време на фазата на растеж. Средата се сменя при D2 и D4.

При сливането на клетките (при D7) средата се сменя:

Основната среда остава същата (DMEM), но е допълнена с 10% фетален телешки серум (FCS) и инсулин (5 μg/mL) (SIGMA).

След това средата се сменя при D9 и D11.

При D14, D16 и D18 се прави лечение със състава, чиято ефективност върху синтеза на лептин се търси да се провери.

Протоколът е обобщен в таблицата по-долу:

Секретираният лептин се определя чрез техника Elisa от сандвич, повторно пускане с комплект за имуноанализ на Leptiin Quantikine M Mouse.

Това определяне на ELISA използва рекомбиниран миши лептин, изразен в Е. coli и антитела, насочени срещу рекомбинантен миши лептин.

Тестът използва "сандвич" имуноензимна техника. Ямките на микроплаки са облицовани с миши лептиново поликлонално антитяло.

Стандартите, контролите и пробите се депонират в ямките и в същия момент целият наличен лептин се свързва с имобилизираното антитяло.

След това свързаният лептин се открива от миши антилептиново антитяло, което е свързано с ензим пероксидаза. След това в ямките се добавя субстратен разтвор. Ензимната реакция води до син разтвор, който става жълт след добавяне на разтвор за охлаждане.

Интензитетът на измерения цвят е пропорционален на количеството на наличния лептин. Отчитането на оптичната плътност се извършва при 450 nm на спектрофотометъра.

Определянето се получава след това на кривите доза-отговор във връзка с измерването на естествения лептин, успоредно на стандартните криви, получени с „рекомбинантен“ стандарт Quantikine M. По този начин комплектът Quantikine M позволява да се определят относителните стойности на масата за естествения лептин на мишката.

Оптичната плътност, измерена при 450 nm, е пропорционална на количеството фиксирано антитяло, което само по себе си е пропорционално на количеството лептин, присъстващо първоначално. Резултатите се изразяват в pg/mL лептин, присъстващ в клетъчните супернатанти.

Пробите бяха тествани в три екземпляра.

Тествани са три състава, съдържащи съответно 0,25, 1 и 2 μg/ml фитосфингозин или неговия хидрохлорид.

За адипоцитите 3T3-F442A, които се поддържат в културата без никакво третиране, количеството лептин, присъстващо в супернатантите на културата, се увеличава силно с времето (16,4 pg/ml при D4, 802 pg/ml при D11 и 2,623 pg/ml при D20) . Този резултат е в съответствие с биологичните данни (Leroy P. 1996, Considine R V. 1996): при базални условия мишите адипоцити отделят нарастващи количества лептин през цялото време на тяхното съзряване. По този начин потвърждаваме, че зрелият адипоцит отделя количества лептин, които са по-големи от тези на преадипоцит.

Количествата лептин, присъстващи в супернатантите, са отчетени в таблица 1 по-долу. Съкращението PS обозначава фитосфингозин.

След 7 дни лечение, т.е. на ден D21, фитосфингозин предизвиква увеличаване на секрецията на лептин от третирани адипоцити, ефект, който е максимален при концентрация от 0,25 μg/ml. Увеличението е с малко повече от 18% при тази концентрация.

Фитосфингозин хидрохлоридът, когато се тества при същите условия, е отговорен и за стимулиране на секрецията на лептин: + 52% при 1 μg/ml и + 26% при 2 μg/ml и + 18% при 0,25 μg/ml. Резултатите за хидрохлорида са представени в таблица 2 по-долу.

По този начин фитосфингозинът е способен да индуцира увеличаване на базалната адипоцитна секреция на лептин в мастната клетка 3T3-F442A, модел, който е много близък до човешкия адипоцит. По този начин фитосфингозинът може да играе важна роля в контрола на стабилността на мастната маса.

Демонстрация на интереса към комбинацията на фитосфингозин с активатор на аденилат циклаза, като екстракт от Coleus forskohlii, за насърчаване на намаляването на липогенезата в мишите адипоцити в културата.

1. Принцип на изследването

Това проучване е свързано с ефектите от комбинацията на двата активни вещества, Coleus forskohlii (наричан също Plectranthus barbatus) (PB) и фитосфингозин (PS) за набиране на нови адипоцити.

Известно е, че развитието на бяла мастна тъкан представлява процес, който е непрекъснат през целия живот (AILHAUD G., GRIMALDI P., NEGREL R., Trends in Endocrinology and Metabolism, (1994) 5 (3) 132-6) . Адипоцитът е свързан в мастната тъкан с изобилна извънклетъчна матрица, която включва също ендотелни клетки, капиляри, нервни влакна и фиброадипобластни предшественици. Зрелият адипоцит представлява фенотип на клетка, произхождаща от диференциацията на адипоцитен предшественик. Преадипоцитите се намират в същата мастна тъкан и могат да бъдат наети на всеки етап от живота, за да се генерират нови адипоцити: в случай на наддаване на тегло съществува начална фаза на увеличаване на обема на адипоцитите, докато се достигне критична точка, което след това води до набиране на нови клетки (Bjorntorp P., Int. J. Obesity, (1991) 15 67-81). Вътрешният капацитет на преадипоцитите да се размножават и да се диференцират в адипоцити играе определяща роля в развитието на мастните маси. Хиперплазия на тези клетки, свързана с фибробластите, води до увеличаване на мастната тъкан.

По този начин, зрелите адипоцити първо се третират с PB + PS

На второ място, хранителната среда, която е обусловена с тези адипоцити, се поставя в контакт с преадипоцити, чието съзряване в адипоцити ще бъде последвано.

Контролните клетки в началото на лечението започват да се диференцират и претърпяват определен брой промени: увеличаване на обема, увеличаване на броя и размера на липидните капчици, увеличаване на активността на липогенетичните ензими и др.

Ключов ензим в процеса на синтез на триглицериди е глицерол-3-фосфатдехидрогеназата (G3PDH): специфичната му активност се увеличава значително по време на зреенето и по този начин може да се използва като прецизно и чувствително измерване на конверсията на адипоцитите (Pairault J., Green H., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, (1979) 76, 5138-42; Koekemoer TC et al, Int. J. Biochem. Cell Biol. (1995) 27, 625-32).

Избрано е да проследи развитието на активността на този ензим, за да се измери състоянието на диференциация на адипоцитите.

Тъй като G3PDH е хидроразтворим ензим, неговата активност се измерва в супернатанта на клетъчното смилане, в присъствието на подходящи субстрати (NADH, TEA (триетаноламин) —EDTA, 50 mM, 1 mM).

Конкретната активност се изчислява от тези определяния. Третираните клетки се сравняват с контролните клетки. Тъй като G3PDH е отражение на състоянието на диференциация на клетките, колкото по-висока е неговата специфична активност, толкова повече клетките се диференцират и обратно: колкото по-ограничен е мастният резерв от тествания агент, толкова повече активността на G3PDH ще бъде по-ниско.

Средната стойност за три измервания по отношение на стандартно отклонение дава средна специфична активност. След това се изчислява процентното инхибиране на инхибирането на активността на G3PDH, произведено от веществата, в сравнение с контролите.

Критериите, които позволяват да се гарантира качеството на добрите антилипогенетични агенти, са, от една страна, процентно инхибиране на ензима, което е по-голямо от 50%, а от друга страна, сурови данни, които са значително различни по отношение на контролите.

2. Материал и методи

а) Култура и лечение

Адипоцитите, подложени на диференциация, не много зрели адипоцити, наричани също преадипоцити, получени при D7 от протокола, даден в пример 1, се третират със средата, която е обусловена от зрели диференцирани адипоцити, които не са третирани или третирани с PB или PS и с комбинацията PB + PS за 8 дни със смяна на средата в дни D9 и D11, както е посочено в протокола по-долу.

Фитосфингозинът беше тестван при крайни концентрации от 0,25, 0,50 и 1 μg/mL.

Екстрактът де Plectranthus barbatus (PB) (партида № 0B2, INDENA) се титрува при 80% форсколин, молекула, която е призната за ефектор на аденилат циклаза (Seamon K. et al., PNAS USA, (1981) 78 3363-67) . Концентрацията на PB, използвана в проучването, е 25 μg/mL от майчин разтвор при 20 mg/mL в етанол.

б) Приготвяне на клетъчните екстракти

Клетъчната запушалка се измива два пъти с PBS буфер и клетките се възстановяват чрез надраскване в 25 mM TRIS-HCl буфер, рН 7,5, съдържащ 1 mM EDTA при 4 ° C. Клетките се хомогенизират чрез смилане и центрофугиране при 10 000 g за 10 минути при 4 ° C.

Следният протокол е обобщен в таблицата по-долу.

в) Определяне на активността на глицеро-3-фосфат дехидрогеназата (G3PDH).

Определянето на активността на G3PDH се извършва по метода на Kozak и Jensen: Kozak и Jensen, 1974, J. Biol. Chem., 249, 7775-7781.

G3PDH катализира следната реакция:

Консумацията на NADH като функция от времето се измерва чрез спектрофотометрия (KONTRON) при 340 nm. По този начин може да се изчисли вариация на абсорбция/минута (Δ Abs/минута), която съответства на първоначалната скорост на ензимната реакция. Резултатите се изразяват в специфична активност (SA), т.е. в nmoles на NADH трансформиран/min/mg протеини. Общото съдържание на протеин се оценява по метода BCA (Protein Assay Reagent-PIERCE LTD)

SA = 81,25 × Δ ⁢ ⁢ Abs ⁢/⁢ мин × 1 mg ⁢ ⁢ от ⁢ протеини
3. Резултати

Измерване на активността на глицеро-3-фосфат дехидрогеназата (G3PDH).

Количествата NAD + след 8 дни като функция от обработките на културите са отчетени в Таблица 3 по-долу.

Резултатите от Таблица 3 по-горе също са представени на ФИГ. 1.

След 8-дневен контакт със средата, която е обусловена от зрели адипоцити, се наблюдава забавяне на узряването на преадипоцитите със средата, съдържаща PB (инхибиране на активността на G3PDH) и това съответства на инхибиране на набирането на преадипоцити, чиято активност на ензима маркер на зреене се инхибира със 75%.

Фитосфингозин не модифицира този антилипогенетичен профил: комбинацията PS + PB причинява между 74 и 79% от инхибирането на активността на G3PDH, комбинацията 1 μg/mL PS + 25 μg/mL PB дори води до забавяне на липогенезата от тези преадипоцити по време на съзряването, което е малко по-голямо, отколкото само при РВ.

б) Анализ на морфологията на адипоцитите

Успоредно с това, морфологията на адипоцитите беше анализирана чрез директно наблюдение на клетките в чашките на Петри, под микроскоп с обратна фаза (Olympus BH2). Клетките се считат за диференцирани чрез морфологичен анализ, когато придобият кръгло обкръжение и че тяхната цитоплазма е пълна с липидни капчици. Обратно, намаляването на количеството липидни вакуоли, което е свързано с по-удължена форма, свидетелства за забавяне на това съзряване.

В присъствието на комбинацията PS + PB, клетките се характеризират с много изразена делипидация на адипоцитите, което е в съгласие с понижаването на активността на G3PDH ензима, измерен преди.

ФИГ. 2, 3 и 4 показват, съответно:

Фиг. 2: клетките на контролна култура при D7. В тази култура клетките не са много диференцирани, няма много липидни вакуоли. Това е началото на лечението.

Фиг. 3: клетките на контролна култура при D21. Клетките са заредени с липидни вакуоли.

Фиг. 4: клетките на култура, третирана с комбинацията от 25 μg/mL PB + 1 μg/mL PS.

Това проучване показва, че лечението с PB + PS комбинация от зрели адипоцити дава информация, която може да забави натрупването на триглицериди в преадипоцитите. Намаляването на активността на липогенетичния ензим G3PDH води до изчерпване на значителни вътреклетъчни липидни капчици.

Добавянето на фитосфингозин, способен да стимулира секрецията на лептин, не инхибира масивното действие на PB върху намаляването на липидите.

По този начин поддържането на лептин в околната среда близо до адипоцитите може да упражни ролята си на сигнална молекула, действаща срещу увеличаването на мастната маса. Човек се изкушава да повярва, че колекция от клетки, съдържащи клетки, които са изпразнени от част от съдържанието на триглицериди чрез липолиза, като продължават да излъчват ретроконтрол лептиново съобщение, трябва да допринесат за намаляване на съхранението на мазнини от panniculus adiposus.

Демонстрация върху човешките адипоцити в културата на активността на фитосфингозин и на комбинацията от фитосфингозин с екстракт от Coleus forskohlii, за производството на лептин и за липолизата.

Човешки адипоцити, произхождащи от пластика на 41-годишна жена, които се предлагат на пазара от ZEN-BIO (САЩ), са били използвани в напреднал стадий на зреене на адипоцитите. Приемането на тези клетки в култура се извършва 16 дни след засяването. Те се култивират в специфична среда, осигуряваща диференциацията им през цялото лечение.

  • D-16: сеитба
  • D0: начало на лечението с екстракт от Колеус (PB) и/или фитосфингозин (PS)
  • D6 до D18: определяне на различните параметри.

Свойствата на Колеус описаните по-горе за мишите адипоцити 3T3F442A бяха проверени преди всичко върху тези човешки клетки: липолитична активност чрез измерване на освобождаването на глицерол и неестерифицирани мастни киселини.

Таблица 4 по-долу показва стойностите на освобождаване на глицерол в контролните култури и култури, третирани с PS.

Изглежда много ясно, че Колеус много силно стимулира липолизата на адипоцитите (+ 128% увеличение на освобождаването на глицерол на 18 дни по отношение на контрола).

По-нататък, чрез измерване на освобождаването на неестерифицирани мастни киселини, се установява, че Колеус причинява силна хидролиза на адипоцитните триглицериди, като паралелно с глицерола освобождава голямо количество неестерифицирани мастни киселини в доза 25 μg/ml.

Други тестове показват, че фитосфингозинът предизвиква увеличаване на секрецията на лептин в човешките адипоцити, както в мишите адипоцити, като най-ефективните дози са по-ниски за човешките адипоцити.

Успоредно с освобождаването на лептин, фитосфингозинът, в доза 6 ng/ml, е отговорен за освобождаването на глицерол с течение на времето, без съпътстващо освобождаване на неестерифицирани мастни киселини. Това наблюдение може да съответства на нова форма на липолиза, която е подходяща за лептина и която вече е описана в публикации.

ФИГ. 5 и 6 представят еволюцията на морфологията на клетките при току-що посочените условия.

Фиг. 5 представя контролна култура на човешки адипоцити на ден D18.

Ясно се вижда значително количество мастни вакуоли.

Фиг. 6 представя култура от човешки адипоцити на ден D18, след третиране с комбинация от Колеус (25 μg/mL) с фитосфингозин (6 ng/mL). Изглежда ясно, че фитосфингозинът-Колеус комбинацията води до масивно и видимо намаляване, с липидни капчици, които са по-малко на брой и с по-малък размер. Успоредно с това, по-голям брой клетки придобиват вид на не особено зрели клетки (удължена форма и липса на липидни вакуоли).

По този начин комбинацията от тези два актива води до мощно намаляване на мастните запаси, като модулацията на лептина в околната среда, близка до човешкия адипоцит, е ключова стъпка в това действие.