• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • Запис на ORCID за Bongani B. Nkambule
  • За кореспонденция: [email protected]

Резюме

Обективен За оценка на профилите на метилиране на ДНК на периферни лимфоцити при преддиабет, използвайки животински модел C57BL/6 с високо съдържание на мазнини. Освен това оценихме дали ниската доза аспирин или ниската доза аспирин в комбинация с метформин могат да модулират глобалните нива на метилиране на ДНК в лимфоцитите на периферната кръв.

индуцирано

Методи Двадесет и осем (28) мъжки мишки C57BL/6 бяха използвани в две експериментални фази. Първият експеримент включва животни (n = 16), които са рандомизирани да получават диета с ниско съдържание на мазнини (LFD) или диета с високо съдържание на мазнини (HFD) (n = 8/група) в продължение на 10 седмици. Докато при втория експеримент, мишки, хранени с HFD (n = 15) бяха рандомизирани в 3 групи за лечение, ниска доза аспирин (LDA), LDA и метформин група и клопидогрел група. Профилите на ДНК метилиране на бяха определени с помощта на поточна цитометрия.

Резултати Групата с HFD показва умерено наддаване на тегло и повишени нива на глюкоза в кръвта след хранене в сравнение с групата с LFD след 2 седмици HFD хранене (p Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец
  • Изтеглете powerpoint

Диетичен състав (g/kg)

Експеримент първи

Първият експеримент, насочен към измерване на базовите профили на метилиране на ДНК на изолирани В и Т лимфоцити, след 8-седмично хранене с високо съдържание на мазнини. Проучването включва 5-седмични мъжки мишки C57BL/6 (n = 16). На мишките беше позволено да се аклиматизират седмично, докато получават нормални мишки и имат свободен достъп до вода ad libitum. След това мишките бяха рандомизирани в две групи, LFD и HFD група (n = 8/група). След това животните бяха настанени в отделни клетки (n = 8/клетка) въз основа на съответните им диети (фигура 1). От всяко животно бяха взети двеста микролитра венозна кръв и бяха определени хематологични измервания на глюкоза, инсулин и ДНК метилиране (% 5-метилцитозин) (Допълнителен файл 2). Моноцитите и гранулоцитите бяха изчерпани от пробите от цяла кръв и В и Т лимфоцитите бяха изолирани след това с помощта на системата за разделяне на клетки BD ™ IMag (BD Bioscience, САЩ) (Допълнителен файл 2).

Експеримент втори

В експеримент два оценихме дали краткосрочното лечение с ниски дози аспирин (LDA), LDA с метформин (LDA + MET) и клопидогрел модулира профилите на метилиране на ДНК при HFD-хранени (HFF) мишки. Петнадесет (n = 15) HFF мишки бяха рандомизирани в три третирани групи (n = 5/група). Те включват; (1) ниска доза аспирин (LDA) (3 mg/kg) (Kroesen et al., 2018) група; (2) LDA и метформин (150 mg/kg) (Saisho, 2015) група и клопидогрел (0,25 mg/kg) (Iannacone et al., 2007). Мишките са получавали съответното си лечение в продължение на 6 седмици чрез ежедневен орален сондаж (фигура 1). След това се взема кръв и се определят серумните нива на инсулин, хематологичните индекси, профилите на метилиране на ДНК (допълнителен файл 2).

Статистически анализ

Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc .; La Jolla, CA, USA). Сравненията на изходните измервания между двете диети групи LFD и HFD бяха извършени с помощта на несдвоен t-тест за параметрични данни и отчетени като средно и стандартно отклонение. В допълнение, еднопосочният дисперсионен анализ (ANOVA) е използван за сравнения на нивата на метилиране на ДНК в трите лечебни групи, последвано от пост-хок теста на Bonferroni. Докато непараметричните данни бяха анализирани с помощта на теста Mann Whitney U и отчетени като среден и интерквартилен диапазон. За сравнения в трите лечебни групи е използван тестът на Kruskal-Wallis, последван от множествения тест за сравнение на Dunn. Зависимата променлива беше общото ниво на метилиране на ДНК (% 5-метилцитозин), докато независимите променливи бяха подгрупите на лимфоцитите, лекарството за лечение и диетичната група. Р-стойност 0,05).

Изходни метаболитни и хематологични характеристики

Сравнение на глобалните нива на метилиране на ДНК между различни клетъчни подмножества при преддиабетни мишки (HFD)

Групата HFF има повишена експресия на% 5mC върху циркулиращите периферни кръвни лимфоцити в сравнение с групата LFF (p = 0,049). По-специално, Т лимфоцитите, изолирани от HFD групата, също показват повишени нива от% 5mC (p = 0.038) в сравнение с LFD групата. Въпреки това, в изолираните В лимфоцити нивата на% 5mC са сравними между двете диетични групи (p = 0,43) (Таблица 3).

% 5-метил цитозинови нива при HFD-хранени в сравнение с LFD-хранени мишки

Промени в хематологичните индекси при мишки, лекувани с HFD

Имаше значителни разлики в нивата на циркулиращия лимфоцит (F (3,16) = 5,44, p = 0,010), моноцитите (F (3,16) = 3,69, p = 0,033) и тромбоцитите (x 2 = 9,08, p = 0,028). Тестът след хок показва, че лимфоцитите са значително повишени в групата с HFD в сравнение с групата LDA + MET (p 0,05) (Таблица 4).

% 5-метил цитозин нива в нетретирани HFD-хранени в сравнение с третирани HDF-хранени мишки

Глобални нива на метилиране на ДНК при хранене с HFD в сравнение с третирани мишки

За да се оцени дали профилите на метилиране на ДНК са модулирани след краткотрайно лечение от 6 седмици, сравнихме нивата на% 5mC в три групи на лечение. Имаше значителни промени в нивата на Т клетки, експресиращи 5mC (F (4, 20) = 6.34, p = 0.0016), но не и в общия лимфоцит (F (3, 16) = 1.59, p = 0,2311) и В клетъчна популация (F (3, 16) = 1,472, p = 0,2597). Post-hoc тестът, сравняващ нивата на експресия на% 5mC върху Т клетки, показа, че LDA значително понижава нивата на% 5mC на Т клетки (p = 0.0045). В допълнение, лечението с клопидогрел също понижава нивата на% 5mC, изразени върху Т клетки в сравнение с групата LDA + MET (p = 0,0051) (Таблица 4).

Дискусия

Епигенетичната модификация, по-точно метилирането на ДНК, може да повлияе на отговора на клопидогрел (Zhang et al., 2017). Съобщава се също, че възрастта и индексът на телесна маса (ИТМ), които са някои от рисковите фактори за диабет тип 2 и метаболитен синдром, са значително свързани с отговора на клопидогрел (Cuisset et al., 2009; Khalil et al., 2016) . Съобщава се също така, че пациентите с диабет проявяват лош антитромбоцитен ефект при лечение с клопидогрел в сравнение с недиабетици (Angiolillo et al., 2005; Serebruany et al., 2008), явление, което все още не е изяснено.

Въпреки че ниските дози аспирин и клопидогрел са били използвани като двойна терапия за първична профилактика на сърдечно-съдови събития при пациенти с T2DM. Съобщена е значителна честота на големи нежелани сърдечни събития (MACE). Изследването на ролята и асоциацията на Т-клетъчно специфично метилиране на ДНК с действие на клопидогрел може да помогне за изясняването на възможните фактори, свързани с различните отговори на пациентите (Khalil et al., 2016). Всъщност Garcia-Calzon et al. Съобщават, че метилирането на ДНК върху гените-транспортери на метформин в човешкия черен дроб се различава в зависимост от прилаганото антидиабетно лекарство (Garcia-Calzon et al., 2017). В нашето проучване LDA значително намалява нивата на Т-клетъчно специфично глобално метилиране на ДНК в преддиабетно състояние. Изненадващо, в нашето проучване не се наблюдава синергична модулация на глобалното метилиране на ДНК на Т клетки. Тези нови открития биха могли да предполагат потенциална представа за променливите отговори на противовъзпалителните лекарства сред пациентите, живеещи с T2DM. Постоянното активиране на Т-клетки, което е започнато в преддиабетната фаза, може да продължи по време на лечението и да доведе до повишен тромботичен риск.

Настоящото проучване беше ограничено до основните клетъчни лимфоцитни линии и не беше извършено подтипиране на Т-клетки, за да се очертае дали съществуват разлики в подгрупите на Т-клетките. Активираните Т клетки са замесени в коронарна артериална болест, остават едно от макросъдовите усложнения, свързани със захарен диабет тип 2. В допълнение, широко епигеномно проучване разкрива, че хипометилирането в рамките на гена, свързан с фактор 3 на туморния некротичен фактор (TRAF3), е свързано с повишена агрегация на тромбоцитите и рецидив на съдовете при пациенти с исхемичен инсулт, които са били на лечение с клопидогрел (Gallego-Fabrega et al., 2016). Освен това по-високата експресия на TRAF3 поради намаленото метилиране може да доведе до увеличаване на CD40 сигналния път (Song et al., 2011; Kuijpers et al., 2015). CD40 участва в костимулацията и активирането на Т клетки (Song et al., 2011). Остава неясно дали хипермитилираните Т клетки запазват функционалния си капацитет и дали това може да повлияе на имунологичните отговори при пациенти, живеещи с T2DM.

Заключение

Т клетките участват в първоначалното смущение на профилите на метилиране на ДНК в патогенезата на възпалението, инсулиновата резистентност и впоследствие диабет тип 2. Аспиринът с ниска доза е ефективен за модулиране на специфично за Т-клетките глобално метилиране, докато клопидогрел не показва модулиращ ефект върху профила на метилиране на ДНК след краткосрочно хранене с високо съдържание на мазнини. Това може да предполага, че ранните промени в профилите на метилиране на ДНК на Т клетки се медиират от възпаление и могат да бъдат обърнати чрез използване на ниски дози аспирин.

Финансиране

Това проучване е финансирано от Университета на Квазулу-Натал, Колеж по здравни науки в рамките на финансирането на разходите за изследвания. Освен това работата се основава на изследванията, подкрепени отчасти от Националната изследователска фондация на Южна Африка [Grant Numbers: 107519]; и от Южноафриканския съвет за медицински изследвания в рамките на самоинициативен грант за научни изследвания (номер 9894). Изказаните мнения и мнения са на автора (авторите) и не представляват непременно официалните възгледи на SA MRC. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Принос на авторите

TM и BBN създадоха идеята и дизайна на изследването, както и анализ на резултатите. ZM и PVD помогнаха за изготвянето на статията. Всички автори са написали и одобрили окончателния ръкопис.

Конкуриращи се интереси

Авторите нямат конкуриращи се интереси, които да декларират.

Етично одобрение

Изследването е одобрено от Комитета по етика на изследванията на животните към Университета на Квазулу Натал (AREC) с етичен номер: AREC/086/016.

Благодарности

Университетът на KwaZulu-Natal (UKZN) Отдел за биомедицински ресурси (BRU) е признат за помощта при лабораторни процедури за мишки и съоръжения за отглеждане на животни. Освен това, UKZN Департамент по физиология на човека, Колеж по здравни науки (CHS) е признат за предоставяне на достъп до съоръжението за анализ на поточната цитометрия.