РЕЗЮМЕ

ВЪВЕДЕНИЕ

От 70-те години на миналия век амбулаторната парентерална антимикробна терапия (OPAT) е жизнеспособна възможност за пациенти, които се нуждаят от интравенозни антибиотици, поради което хоспитализацията се счита за ненужна. Въпреки това, OPAT изисква поставянето на устройство за дългосрочен венозен достъп (т.е. периферно поставен централен катетър [PICC]) и координация на инфузионните услуги в дома или медицинския кабинет. Поставянето на PICC линии може да доведе до забавяне на изписването от болницата и може да бъде свързано с усложнения. PICC линиите също са свързани с непланирани посещения на спешни отделения за усложнения, включително инфекции или съсиреци, които често водят до хоспитализация.

цефтриаксон

Докато интрамускулното приложение е често срещан и одобрен начин на приложение на някои антибиотици (напр. Цефтриаксон) от FDA, то често е свързано с болка и локален дискомфорт (1). Подкожното приложение на антибиотици предлага предимства пред няколко ограничения, свързани с интравенозните и интрамускулните пътища, подчертани по-горе. Понастоящем няма одобрени антибиотици за подкожно приложение в САЩ. Цефтриаксон обаче е одобрен за подкожно приложение във Франция. Въпреки че се съобщава, че няколко антибиотици се прилагат подкожно, са наблюдавани високи нива на нежелани събития, включително некроза на кожата (2). Множество фактори могат да повлияят на поносимостта при подкожно приложение на лекарството. Тези фактори включват обем/скорост на инжектиране, вискозитет, pH, осмолалитет, разредител, буфер и буферна концентрация (3, 4). Целта на това проучване е да се разработи модел на некроза на животински тъкани, за да се оцени локалната поносимост на подкожната доставка на цефтриаксон при различни концентрации и скорости на приложение.

РЕЗУЛТАТИ

Не са наблюдавани груби лезии при животни с отрицателен контрол. Микроскопското изследване на кожата на плъхове обаче показва доказателства за екзогенни ефекти при инжектираните животни в сравнение с нетретираните контроли. Животните, на които е прилагана „фиктивна“ игла/нормални физиологични инжекции, ясно показват нарушаване на тъканите и изразена подкожна хронична (лимфоцити и хистиоцити) възпалителна инфилтрация с ангиогенеза, както и фокален кръвоизлив (фиг. 1). Инжекциите с калиев хлорид водят до некроза на кожата с пълна дебелина с подкожна атрофия, което не се наблюдава при инжектирани с физиологичен разтвор животни; се наблюдава възпаление на мускулния панникулус (MP) с различни степени на увреждане на миоцитите (фиг. 2). Като оптимално условие за последващо сравнение беше определена концентрация от 2 meq/2 ml; локалните лезии с умерена тежест се наблюдават най-последователно без преждевременно прекратяване на проучването поради обширно формиране на ешар и етични опасения. Резултатите от хистопатологичния индекс варират от 7,5 до 17,75 за физиологичен разтвор (отрицателни) контроли (медиана, 11,3) и от 18,5 до 41,25 за контроли с калиев хлорид (положителни) (медиана, 27,1) (P = 0,005 от тест на Ман-Уитни).

Представителни хистологични находки с отрицателната контрола (натриев хлорид, 0,9%). Показано е H&E оцветяване. Формалин-фиксираните парафинови вградени 4-μm тъканни участъци показват нормален епидермис, дерма и мускулен панникулус (MP) и подкожно отделение с леки хронични възпалителни клетки в мястото на инжектиране. Епидермисът и дермата с придатъчните космени фоликули и мастните лобули са нормални, с непокътнати и добре дефинирани рогови слоеве, слоеви гранулози, слоеве спинозум и слоеви базални слоеве (горе вляво и вдясно). Аднексите са без атрофия или увреждане, а дермалната васкулатура е нормална, без увеличен брой (телеангиектазии), калибър или дебелина на стената (горе вляво и вдясно). Мускулният панникулус съдържа нормален калибър на мускулните клетки, периферно ядрено местоположение и външен вид на мускулните влакна, без увеличена интерстициална космическа течност (оток) или необичайно увеличени кръвоносни съдове (долу вляво). Подкожната мастна тъкан е вътре в MP (долу вдясно), с разпръснати хронични възпалителни клетки, които са предимно лимфоцити с редки плазмени клетки с фокални екстравазирани червени кръвни клетки. По-специално липсват остри възпалителни клетки, неутрофили/полиморфноядрени клетки (ПМН) и откровен кръвоизлив. Увеличения, × 4 (горе вляво) и × 20 (други).

Представителни хистологични находки с положителната контрола (калиев хлорид, 2 meq/2 ml). Показано е H&E оцветяване. Титрираният положителен контрол запазва непокътнат епидермис с фокална повърхностна спонгиоза и хронично възпаление и дерма с всички нормални придатъци (отгоре). Останалият епидермис е нормален с добре поддържани слоеве (горе вдясно). Мускулният панникулус е оточен (увеличено пространство между мускулните клетки) с телеангиектазия (увеличени съдове) и задръствания (лумени, пълни с червени кръвни клетки и без видим фибрин) (долу вляво). Освен това мускулният панникулус съдържа смесен остър-хроничен възпалителен инфилтрат с предимно лимфоцити, плазмени клетки и рядко неутрофили (долу вляво). Подкожното пространство демонстрира телеангиектазия и съдова конгестия с подчертано изтичане на капиляри (екстравазирани еритроцити и фибрин), оток и хронично възпаление (горе вляво [зелена кутия] и долу вдясно). Увеличения, × 4 (горе вляво) и × 20 (други).

Типични хистологични находки за животни, прилагани приблизително 125 mg/ml цефтриаксон за 1 min. Показано е H&E оцветяване. Разрезите показват непокътнат епидермис с всички нормални слоеве и дерма без аномалии и нормални придатъци. Мускулният панникулус е нормален. Подкожното отделение съдържа кавитарен кръвоизлив, повишена фиброза, фибринозна некроза, загуба на адипоцити и лимфоплазмацитичен хроничен възпалителен инфилтрат. Увеличения, × 4 (горе вляво) и × 20 (други).

Типични хистологични находки за животни, прилагани приблизително 25 mg/ml цефтриаксон в продължение на 120 минути. Показано е H&E оцветяване. Епидермисът, дермата и мускулният панникулус са нормални. Леко хронично възпаление се отбелязва в подкожното отделение, със задържане на нормални адипоцити без телеангиектазия, некроза, фиброза, кръвоизлив, остро възпаление или тежко хронично възпаление. Увеличения, × 4 (горе вляво) и × 20 (други).

Сравнение на резултатите от хистопатологията от различни кохорти на лечение. NaCl, нормален физиологичен разтвор при 0,9% (тегл./Об.) (2 ml); KCl, калиев хлорид при 2 meq/2 ml. Цефтриаксон (CRO) е даван при 1000 mg/kg дневно за всички групи. Всяка опорна точка представлява средната оценка за 4 квадранта от животно. Хоризонталните ленти представляват медианите за всяка група. *, P 75-годишна възраст, които са получили подкожен цефтриаксон, съобщават, че не е установено нежелано събитие, свързано с подкожното приложение на цефтриаксон (8). Подкожното приложение на антибиотици не е свързано с намалена ефективност или повишена смъртност.

В друго проспективно наблюдателно многоцентрово проучване подкожното приложение на антибиотици е свързано с чести, макар и доброкачествени локални неблагоприятни ефекти (3). Болката е най-честият докладван нежелан ефект. Класът на приложените антибиотици, бърза инфузия на антибиотик (400 mg/ml) е даден като болусна инжекция (9). Използвайки фракционен дизайн, впоследствие установихме, че концентрацията на лекарството може да бъде свързана с локалния възпалителен отговор на тъканите. Отбелязахме, че чрез намаляване на концентрацията на лекарството с по-голям обем инфузия, продължителността на приложението на лекарството също вероятно ще бъде удължена. Въпреки това, прилагането на една и съща концентрация на лекарството само за по-дълъг период от време не е довело до подобряване на резултатите по хистопатология. Тези наблюдения предполагат, че локалната концентрация на лекарството има по-голямо въздействие върху възпалителния отговор на тъканите, отколкото продължителността на приложението на лекарството. Въздействието на междинната продължителност на приложението на цефтриаксон (над 30 минути) беше проучено накратко, но не беше установено, че е много полезно при понижаване на хистопатологичния резултат (данните не са показани).

Имаше няколко ограничения за нашето проучване. Първо, оценихме само in vivo локалната тъканна реакция в края на междинна времева рамка (т.е. 12 дни); по-голяма продължителност би могла да бъде по-информативна за хронична терапия. Второ, не са предприети надлъжни оценки (последователно с течение на времето), за да се разбере началото и скоростта на локалния възпалителен отговор. Трето, не разгледахме обратимостта/възстановяването на локалния възпалителен отговор при прекратяване на подкожното приложение на лекарства. И накрая, беше изследван само един цефтриаксон; нашите констатации може да не са пряко приложими за други търговски формулировки на цефтриаксон. Водени от нашите предварителни резултати, текущите проучвания валидират нашите констатации в модел за млади прасета, който се счита за по-голям от клинично значение поради сходството с анатомията на човешката кожа (т.е. сходна дебелина на кожата, липсата на мускулен панникулус при плъхове и груба и рядка коса, а не козина, както при плъховете). Бъдещите указания включват допълнително валидиране на резултата от кожния възпалителен хистопатологичен индекс от повече от 2 микроскописти, включително изчисляване на точност между дни и интеробсервър.

В обобщение беше установено, че инфузията на цефтриаксон се понася доста добре в модел на некроза на животински тъкани. Локалният тъканен отговор беше значително намален, когато същата доза цефтриаксон се дава с по-ниска концентрация (25 mg/ml) за по-дълъг период от време (120 минути). Ако бъде утвърден, моделът може да бъде инструментална платформа за разработване на лекарства за оценка на различни фармацевтични формулировки за подкожно доставяне.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Антимикробни агенти и реактиви. Патентована формулировка на цефтриаксон за инжекции (USP) (партиден номер 0001D81) е получена от ACS Dobfar (Tribiano, Италия). Инжекция за натриев хлорид (0,9%, тегл./Об.) (USP), концентрат за калиев хлорид (2 meq/ml) (USP) и непирогенна стерилна вода за инжекции (USP) са закупени от Henry Schein Animal Health (Дъблин, ОН). Свеж разтвор на цефтриаксон се приготвя в стерилна вода, разрежда се до желаните концентрации и се използва веднага всеки ден.

Животни. Използвани са плъхове Sprague-Dawley (женски, 225 до 250 g; мъжки, 325 до 350 g) (Envigo RMS, Inc., Indianapolis, IN). Всички животни са обгрижвани в съответствие с най-високите хуманни и етични стандарти, одобрени от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните (IACUC) към университета в Хюстън. Плъховете получават храна и вода ad libitum. Преди всеки експеримент, плъховете бяха обръснати с машинки за подстригване в началото и когато е необходимо. Гърбът на всяко животно беше разделен на 4 квадранта (т.е. с оси по средната линия/гръбначния стълб и средния гръден кош), като инжекциите се въртяха всеки ден сред квадрантите. Перорален разтвор на ацетаминофен (1,6 mg/ml в питейна вода) е осигурен за контрол на дискомфорта при животните. Приготвя се пресен разтвор на ацетаминофен на всеки 3 до 4 дни по време на проучването. Не са използвани нестероидни противовъзпалителни средства (напр. Карпрофен), тъй като те могат да повлияят на активирането на тромбоцитите и възпалението на тъканите (крайни точки на проучването).

Експериментален дизайн и оценка на безопасността. Продължителността на всеки експеримент е била 12 дни, за да се имитира типичен курс на антибиотик. Животните (n = 6 за всяка група; 3 животни от всеки пол) бяха поставени под упойка (с изофлуран) преди всяка инжекция. След подходяща подготовка, кожата беше притисната в триъгълник за поставяне на игла между два пръста, успоредни на тялото, за да се позволи проникване в подкожното пространство. Използвана е 27-габаритна игла и различни агенти се инжектират подкожно веднъж дневно.

Оценка на местната поносимост. Всяко животно е инспектирано ежедневно за доказателства за непоносимост на кожата, включително некроза. Всеки кожен квадрант беше визуално проверен за зачервяване, уплътняване (или осезаем издутина или признаци на тъканни отоци), петехии (червени петна, показващи изтичане на капилярите), мащаб (лющене на кожата), серумна кора (краста), дренаж (серозен, кръвен, или смесени), гнойно отделяне/гной (остро възпаление [неутрофили]), неприятна миризма (признаци на инфекция на кожата и меките тъкани) или образуване на черен ешар (определящ за некроза и необратимо увреждане на тъканите). Визуализацията на черен ешар би прекратила изследването. Не се очакваше появата на мехури и няма да прекрати експеримента, освен ако не надвишава> 1 cm в диаметър. Поведението на животните беше отбелязано като заместител за оценка на болката, което включва оттегляне по време на работа, оттегляне при леко докосване до мястото на инжектиране, разклащане, извиване на гърба, навиване на опашката и намалена консумация на храна или вода. В края на експеримента плъховете бяха умъртвени чрез задушаване на СО2 поне 3 часа след последното инжектиране.

След евтаназия цялата гръбначна кожа беше изрязана до миофасциалната равнина на гърба и гръдния кош. Отбелязани са области на повишена адхезия (предполагаща фиброза) или зачервяване (предполагаща ангиогенеза или кръвоизлив). Вземането на проби от ексцизия и ударна биопсия (кръгъл режещ ръб, 5 mm до 8 mm) се извършва от външната повърхност и от изследваната след смъртта долна повърхност на подкожието. Тъканите бяха фиксирани в 10% неутрален буфериран формалин за поне 5 часа преди обработка на тъкани със серийно обезводняване (степенуван етанол), изчистени (ксилол) и вградени в парафинов восък като тъканни блокове по стандартен начин. Фиксираните с формалин парафинови блокове (FFPE) бяха разделени, използвайки рутинни клинични хистопатологични техники, включително микротомия с дебелина от 4- до 7 μm с прехвърляне върху заредени стъклени стъкла; оцветени с хематоксилин и еозин (H&E); калъфка с монтирана среда; и подложени на микроскопичен морфометричен анализ.

Хистопатология. Оценките на локално увреждане на тъканите бяха направени без знание за лечението, прилагано на животните. Глобална оценка на тъканната архитектура е направена при сканиращо увеличение (оригинални увеличения, × 2 и × 4) с помощта на вертикален микроскоп с пропускаща светлина, настроен за парфокално осветление на Köhler (Eclipse Ci [Nikon, Tokyo, Japan] или BX43 [Olympus, Tokyo, Japan ]). При увеличение × 20, изчерпателен преглед на всяко от 4-те тъканни отделения (епидермис, дерма [папиларна и ретикуларна], мускулна панникулус и подкожна мазнина) беше полуколичествено анализиран сред 40 хистоморфологични характеристики (вж. Таблица S1 в допълнителния материал), за да генерират съставна оценка на възпалителния хистопатологичен индекс на кожата, варираща от 0 до 100. Резултатът е валидиран вътрешно между двама изследователи (сертифициран от борда анатомичен патолог [DN Cohen] и опитен микроскопист [B. Guillory]). И двамата следователи първоначално бяха обучени чрез преглед на 10 до 20 дела заедно и независимо вкараха 10 допълнителни дела. Понякога се наблюдаваха незначителни разногласия от 1 до 5 единици. Не са наблюдавани големи разногласия от> 10 точки. Отчетените резултати са тези от индивидуални и консенсусни прегледи.

Статистически анализ. Резултатите от хистопатологията се оценяват независимо за всеки животински квадрант. Ако за квадрант е получена повече от 1 проба (например, понякога, когато се срещне голяма лезия), се използва най-високата оценка за квадранта. Резултатите за 4-те квадранта бяха усреднени за всяко животно. Резултатите от индекса за различните кохорти бяха сравнени с помощта на тест на Крускал-Уолис (непараметричен дисперсионен анализ [ANOVA]), последван от теста на Дън за сравнения с множество групи. Избрани сравнения от 2 групи бяха направени и с теста на Ман-Уитни; р стойност по-малка от 0,01 се счита за значима. Използван е по-висок от конвенционалния праг за намаляване на потенциалния проблем на множество двупосочни сравнения с групата с отрицателен контрол (корекция на Bonferroni).

ПРИЗНАНИЕ

Това проучване е подкрепено от scPharmaceuticals (Burlington, MA).