Редактирано от Wylie Vale, The Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA, и одобрено на 18 август 2009 г. (получено за преглед на 29 юли 2009 г.)

инхибира

Резюме

MCH невроните, които се намират предимно в страничния хипоталамус и в зона incerta, могат също да насочват GnRH неврони директно, тъй като MCH влакната са в тясна апозиция с GnRH неврони (22). MCH действа чрез G-протеин-свързани рецептори MCHR1 (23–27) и MCHR2 (28–30); само MCHR1 присъства в мозъка на гризачите и 50–55% от плъховите GnRH неврони експресират MCHR1 (22). Вътремозъчните вливания на MCH могат да потиснат (31) или да засилят (32, 33) освобождаването на хипофизарен гонадотропин в зависимост от естрогенната среда. Гладуването и ограничаването на храната, което има инхибиторен ефект върху плодовитостта, както се доказва от намалените циркулиращи гонадотропини и ановулацията (34), повишава регулирането на MCH системата (35, 36). Активирана MCH система намалява разхода на енергия и увеличава приема на храна. За разлика от това, дефицитът на MCH при мишки води до слабост и повишен метаболизъм. Въпреки тяхната склонност, нокаутите на MCH (37, 38) и нокаутите на MCHR1 (39) остават плодовити. Системата MCH може също да участва в регулирането на съня (40–42), пристрастяването към наркотици (43, 44) и настроението (45). В момента антагонистите на MCHR1 се разработват като лекарства против затлъстяване и антидепресанти (46, 47).

Въпреки различните функции, приписвани на MCH, драматичния фенотип на нокаутиращите мишки MCH и клиничното значение на MCH, има малко информация за електрофизиологичните ефекти на MCH върху невроните на ЦНС. Наличните проучвания са ограничени до хипоталамусните неврони, които реагират на MCH с пресинаптично инхибиране на освобождаването на предавателя (48, 49). Никога не са докладвани преки ефекти на MCH върху мембранния потенциал на невроните на ЦНС.

MCH невроните плътно инервират медиалната преграда/диагонална лента на гризач на Broca (MSDB) (50, 51), която съдържа холинергични, GABAergic и vGluT2-глутаматергични неврони, както и две субпопулации на GnRH неврони, само една от които се активира от пубертета -задействащ пептид киспептин (19).

В опит да се идентифицират клетъчните цели на MCH в мозъка и да се разберат механизмите, свързващи енергийния баланс с репродукцията, целта на настоящото проучване е да се провери хипотезата, че MCH ще модулира активността на активирания от kisspeptin и чувствителния към kisspeptin MSDB GnRH неврони. Използвайки електрофизиологични записи и анатомични методи за маркиране в множество линии на трансгенни GFP мишки, ние докладваме силни, инхибиращи ефекти на MCH върху активирани с kisspeptin неврони vGluT2-GnRH. Kisspeptin-нечувствителни GnRH, холинергични, GABAergic и глутаматергични MSDB неврони не реагират на MCH. Наблюдаваните инхибиторни ефекти на MCH се медиират чрез директен постсинаптичен механизъм и са с по-голяма степен, отколкото е съобщено за всеки неврон на ЦНС. Тези действия на MCH върху активирани с kisspeptin GnRH неврони могат да осигурят критична връзка между енергийния баланс и репродуктивната физиология.

Резултати

MCH инхибира vGluT2-GnRH неврони чрез MCHR1-трансдуциран директен постсинаптичен механизъм.

MCH инхибира уникална субпопулация на vGluT2-GnRH неврони в MSDB, която може да бъде идентифицирана в резени, приготвени от мишки vGluT2-GFP или GnRH-GFP (19, 52). MCH (1 μM) произвежда 3- до 20 mV хиперполяризация (средно: 8,1 ± 1,5 mV; n = 15) в 59% от vGluT2-GnRH неврони, записани в мозъчни резени, приготвени от 17 постпубертални мишки (n = 22 клетки; 35 –160-дневна възраст). В мозъчни срезове, приготвени от 300 препубертатни мишки (на възраст 12–30 дни), MCH инхибира 60% от изследваните неврони (n = 327) и предизвиква статистически подобна хиперполяризация от 6,7 ± 0,3 mV (диапазон 2–20 mV; n = 149 ). Тъй като невроните както от предпубертетни, така и от постпубертални мишки реагираха подобно на MCH, останалите проучвания бяха проведени в резени, приготвени от мишки преди пубертета.

Инхибиторният ефект на MCH е сходен по амплитуда както при мъжете, така и при жените преди пубертета и показва слаба десенсибилизация към второто приложение на агонист, приложено 5–15 минути след първото (жени, първо приложение на MCH: 8,2 ± 0,7 mV, второ приложение на MCH: 8,1 ± 0,7 mV; n = 20 клетки, записани от 18 мишки; мъже, първо приложение на MCH: 7,8 ± 0,8 mV, второ приложение на MCH: 7,9 ± 0,9 mV; n = 15 клетки, записани от 14 мишки; тест на сдвоени t на студента, без значение; Фигура 1А и Б). Невропептид-глутаминова киселина-изолевцин (n = 9), кокаин- и амфетамин-регулиран транскрипт (n = 11) и несфатин (n = 10) не са имали ефект върху реагиращи на MCH или нереагиращи vGluT2-GnRH неврони; и трите пептида могат да бъдат произведени от MCH неврони (51, 53, 54). По същия начин лептинът (n = 5) и NPY (n = 19), които също сигнализират за наличност на енергийни запаси, не са имали ефект върху активираните с kisspeptin неврони vGluT2-GnRH.

Индуцираната от MCH хиперполяризация в невроните vGluT2-GnRH продължава да съществува в TTX (контрол: 7.1 ± 1.3 mV; TTX: 7 ± 1 mV; n = 7; не е значима, сдвоен t тест на Student) и в „нула“ Ca 2+/висока Mg 2+ ACSF (контрол: 6,5 ± 1,5 mV; „нула“ Ca 2+/висока Mg 2+: 8,5 ± 2 mV; n = 8 клетки; не е значимо), което предполага участието на директен постсинаптичен механизъм (фиг. 1C Е). Както се очаква, MCH-индуцираният инхибиторен ефект е блокиран от MCHR1-антагониста PMC-3881-PI (контрол: 9,8 ± 1,4 mV; антагонист: 0 ± 0 mV; n = 6; P + канали (контрол: 11,6 ± 1,4 pA; Ba 2+: 1,8 ± 0,4 pA; n = 5; тест за сдвоени t на студента; P 2+ самостоятелно произвежда 10,6 ± 3,3 pA вътрешен ток в записите със захранващи напрежения (n = 5). Съвместимо с участието на K + ток, MCH-индуциран външен ток, обърнат при среден потенциал на обръщане от -101 ± 1,7 mV (n = 5), което е близо до изчисленото Ek от -101 mV (фиг. 1L). По този начин, MCH-индуцирано инхибиране на vGluT2-GnRH невроните включва отваряне на Ba 2+-чувствителни K + канали.

MCH избирателно инхибира субпопулация на активирани с киспептин vGluT2-GnRH неврони в MSDB.

Гореописаните ефекти на MCH се наблюдават в много уникална популация от неврони в MSDB. Инхибираните с MCH неврони vGluT2-GnRH могат да бъдат разграничени от другите основни невронални популации в MSDB чрез липсата на възбуждащ отговор на агониста на метаботропните рецептори на глутамат от група I DHPG и чрез тяхното силно и трайно активиране от невропептида, киспектина, естествения лиганд на GPR54 (19, 52). Въпреки че DHPG-чувствителността е изследвана във всеки тестван неврон, поради силния и продължителен характер на реакцията на киспептина, агонистът на киспептина се прилага само в края на експеримента. Чувствителността към kisspeptin беше оценена с помощта на биоактивния фрагмент kissspeptin-10 (KP-10). Общо 75 MCH-реагиращи vGluT2-GnRH неврони бяха потвърдени като KP-10-чувствителни в края на експеримента (Фиг. 2А, В и Е).

MCH-инхибираните vGluT2-GnRH неврони се активират уникално от kisspeptin, но не и от група I метаботропен агонист на глутаматните рецептори, DHPG. (А) Запис на диаграма от текущо закрепен DHPG-нечувствителен GnRH-GFP неврон показва, че невронът реагира на MCH (1 μM, 15 s) със 7-mV хиперполяризация, която продължава 110 s. Същият неврон реагира на биоактивния фрагмент на киспептин, KP-10 (100 nM, 15 s) с продължително възбуждане (измиване не е показано). (B) vGluT2-GFP неврон със сходни свойства. Невронът не беше чувствителен към DHPG, но отговори на MCH с 13-mV хиперполяризация, която продължи 187 s; невронът се активира и от KP-10. (C) Показва, че активиран от DHPG неврон GnRH-GFP, който е нечувствителен към KP-10, също е нечувствителен към MCH. (D) По подобен начин не се наблюдава ефект на MCH в DHPG-активиран, KP-10-нечувствителен vGluT2-GFP неврон. (E) Стълбовата диаграма обобщава данните и също така показва, че холинергичните и GAD67-GFP неврони, разположени в едно и също ядро, не реагират на MCH; както холинергичните, така и GABAergic невроните се активират от DHPG, но не и от KP-10. Обърнете внимание, че подобен процент на DHPG-нечувствителни vGluT2-GFP и GnRH-GFP неврони е инхибиран от MCH; тези неврони най-вероятно представляват същата невронална популация, тъй като GnRH невроните ко-локализират vGluT2 (19).

MCH няма ефект върху 36-KP-10-нечувствителните GnRH-GFP клетки, които са записани в мозъчни срезове, приготвени от 30 мишки (фиг. 2C и E), или върху 47 KP-10-нечувствителни vGluT2-GFP неврони, които са записани от 42 мишки (фиг. 2D и Е); тези неврони бяха силно активирани от DHPG. MCH също няма ефект върху холинергичните (n = 27) или върху GABAergic невроните (n = 12; Фиг. 2Е); и двете невронални популации се активират по подобен начин от DHPG, но не и от KP-10 (19, 55, 56). По този начин, MCH селективно инхибира KP-10 активираните, DHPG-нечувствителни неврони в MSDB.

MCH прекъсва активирано от киспептин активиране на vGluT2-GnRH неврони.

Поради силната връзка между енергийния баланс и възпроизводството, ние след това определихме дали МСН, по силата на своята инхибиторна активност, може да се противопостави на дълготрайния възбуждащ ефект на киспептина. При контролни условия активирането на KP-10 продължава средно 16 ± 1,5 минути (фиг. 3А) (19). В 12 клетки се прилага 100 nM KP-10 за 5 s и след установяване на възбуждащия отговор на KP-10, MCH се прилага за 15 s. MCH прекъсва възбуждащия ефект на KP-10 и произвежда 10,9 ± 1,1 mV хиперполяризация (фиг. 3В). Това прекъсване продължи средно 1,8 ± 0,3 минути (n = 12). В допълнение, поради несенсибилизиращия характер на отговора на MCH, многократните приложения на MCH продължават да блокират активирането на KP-10 (Фиг. 3C). Подобно прекъсване се наблюдава и при записите с напрежение (n = 3) (фиг. 3D).

MCH се противопоставя на активирана от kisspeptin активация в vGluT2-GnRH неврони. (A) KP-10 (100 nM, 5 s) предизвиква продължително възбуждане, което продължава> 17 минути. (B) Клетка, която се деполяризира и започна да стреля в отговор на KP-10, само за да бъде прекъсната от последващо приложение MCH. Инхибирането на MCH продължи 100 s. (C) Втора клетка, в която MCH прекъсва предизвиканото от KP-10 стрелба за 140 s и за 120 s при повторно прилагане. (D) Запис на напрежение със скоба, показващ, че KP-10 индуцира 15-pA вътрешен ток. MCH индуцира 12-pA ток, почти напълно обръщайки индуцирания от KP-10 вътрешен ток, който се връща към първоначалната си величина 240 s по-късно.

MCH имунореактивните влакна присъстват в околността на невроните vGluT2-GnRH на Septal.

Тъй като MCH инхибира KP-10 активирани vGluT2-GnRH неврони, ние специално определихме анатомичната връзка между MCH-имунореактивни влакна и vGluT2-GFP и GnRH-GFP неврони, използвайки vGluT2-GFP (n = 5) и GnRH-GFP (n = 5 ) мишки и добре характеризирани антисеруми срещу MCH (51). В раздели, приготвени от vGluT2-GFP мишки, MCH имунореактивни аксони, оцветени в червено, бяха открити в MSDB и се появиха в непосредствена близост до vGluT2 клетъчни тела и дендрити. В някои клетки много MCH бутони изглежда се свързват с единични GFP клетки (Фиг. 4A-D). По същия начин, при мишките GnRH-GFP, MCH аксоните се появяват в непосредствена близост до GFP клетъчни тела и дендрити (Фиг. 4E-G). Елиминирането на първичното или вторичното антитяло не дава оцветяване, а заместването с антисеруми срещу хипокретин/орексин води до различен модел на оцветяване. По този начин MCH аксоните контактуват с GnRH, както и с невроните vGluT2. Ултраструктурният анализ би помогнал да се отговори на въпроса дали тези контакти имат синаптичен характер.

MCH-имунореактивните влакна се свързват с vGluT2 и GnRH-GFP неврони в MSDB. (A) MCH аксони в MSDB. Мащабна лента, 15 μm. (B-D) Същото поле на микроскоп, показващо MCH аксони (B), vGluT2-GFP неврон (C) и MCH аксони (в червено), свързващи се с vGluT2-GFP невроните (в зелено) (D). Мащабна лента, 9 μm. (E – G) Микроскопско поле, показващо MCH аксони (E), GnRH-GFP неврон (F) и червени MCH аксони при видим контакт със зелени GnRH-GFP неврони. Мащабна лента, 10 μm. Обърнете внимание на сходната форма на vGluT2-GFP и GnRH-GFP невроните.

Дискусия

В настоящото изследване ние докладваме за първи път директно постсинаптично инхибиторно действие на орексигенния пептид MCH върху невроните на ЦНС. Тези ефекти предполагат допълнителна функция на MCH в мозъка. Инхибиторните ефекти на MCH се проявяват в изключителна подгрупа на базалните неврони на предния мозък, а именно vGluT2-GnRH невроните. MCH-индуцираното инхибиране в vGluT2-GnRH невроните се медиира чрез MCH1-рецептор-трансдуциран постсинаптичен механизъм, който включва отваряне на Ba 2+-чувствителни K + канали. MCH-имунореактивните влакна са разположени в непосредствена близост до vGluT2-GFP и GnRH-GFP неврони. Интересното е, че инхибиторните ефекти на MCH могат да прекъснат или блокират постоянния възбуждащ ефект на хипоталамусния пептид кисспептин, който е от съществено значение за репродукцията. Като се има предвид ролята на MCH в енергийния баланс и на kisspeptin за задействане на пубертета и за поддържане на овулацията и плодовитостта, MCH инхибирането на чувствителни към kisspeptin неврони vGluT2-GnRH предполага MCH-медиирана връзка между енергийния баланс и възпроизводството директно на нивото на GnRH неврон.

В настоящото проучване кратки 15-и приложения на MCH произвеждат силно и възпроизводимо инхибиране в силно селективна популация на vGluT2-GnRH неврони, което постоянно се активира от Gq-свързания рецептор GPR54 лиганд kisspeptin, но не и от Gq-свързаната група I глутамат метаботропен рецепторен агонист DHPG. За разлика от това, MCH няма ефект върху DHPG-активирани, нечувствителни към kisspeptin GnRH, vGluT2, холинергични или GABAergic неврони, които са разположени в една и съща базална област на предния мозък. По този начин наблюдаваните инхибиторни ефекти на MCH в MSDB са силно селективни за невронална популация, която участва в задействане на пубертета и поддържане на ключови репродуктивни функции, които са от съществено значение за плодовитостта. Следователно тези открития предполагат нова функция на MCH. В допълнение, липсата на инхибиране на MCH в нечувствителни към kisspeptin, активирани с DHPG GnRH неврони осигурява допълнителна редица доказателства в полза на две популации от GnRH неврони, които изпълняват различни функции по силата на техните невромодулаторни отговори (19).

За разлика от MCH, NEI, CART или несфатин не са имали видим ефект върху мембранните свойства на активираните с kisspeptin неврони vGluT2-GnRH. Липсата на лептин и NPY ефекти върху тези неврони е в съответствие с липсата на лептинови рецептори в GnRH невроните (6); NPY ефекти са докладвани само при лактиращи мишки (58).

Физиологичното значение на наблюдаваните инхибиторни ефекти на MCH е подчертано от нашите проучвания за MCH имунореактивност. Високата плътност на MCH влакна, която наблюдаваме при MSDB при мишки, е в съответствие с по-ранни доклади при плъхове (50, 51, 59). Наблюдаваните близки разпределения между GnRH-GFP невроните и MCH-ir влакна при мишки са в съответствие с проучването при плъхове (22). В допълнение, в нашето проучване бяха забелязани близки разпределения между vGluT2-GFP неврони и MCH влакна, които съответстват на наблюдаваните инхибиторни ефекти на MCH върху vGluT2-GnRH неврони.

При липса на глад, при нормални физиологични условия, MCH невроните са в покой по време на будност, но потенциали за действие на огън по време на сън с бързо движение на очите (REM) (42). В допълнение, изследванията на c-fos показват, че ≈60% от MCH невроните се активират по време на сън след период на REM лишаване от сън (40). Резултатите от нашето проучване биха предсказали намаляване на освобождаването на гонадотропин по време на REM сън и след REM лишаване от сън. Всъщност при плъхове е доказано, че REM лишаването от сън намалява нивата на LH и FSH (68); и при възрастни мъже е установено, че REM сънят е еднакво свързан с намаляването на концентрациите на LH (69).

В заключение, наблюдаваните директни инхибиторни ефекти на MCH върху субпопулация на GnRH неврони, което е от съществено значение за задействане на пубертета и предизвикване на преовулаторен LH скок, предоставят доказателства за критична връзка между енергийния баланс и възпроизводството на нивото на самия GnRH неврон. Тъй като в момента MCH антагонистите се разработват като потенциални антидепресанти и лекарства против затлъстяване, може да е разумно да се разгледат действията им върху репродуктивната система, особено ако се използват за лечение на депресия при анорексични индивиди.

Материали и методи

Записите на скоби за целите клетки са извършени върху GnRH, vGluT2 и GABAergic неврони в мозъчни резени, приготвени от установени линии на трансгенни GFP мишки. MCH и други агонисти се прилагат с помощта на Y-епруветка. Проведена е имуноцитохимия за определяне на MCH инервация на vGluT2-GnRH неврони с помощта на добре установено антитяло [за подробни методи вижте SI].

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от грантовете на Националната здравна институция MH61465, NS41454 и NS48476 и от щата Кънектикът, Департамент по психично здраве и пристрастяване.

Бележки под линия

    1 До кого трябва да се адресира кореспонденция. Имейл: Meenakshi.Alrejayale.edu

Принос на автора: Проучване на М.А. M.W., I.D., E.M. и A.v.d.P. извършени изследвания; A.v.d.P. допринесе нови реактиви/аналитични инструменти; M.W. и I.D. анализирани данни; и М.А.написаха статията.

Авторите не декларират конфликт на интереси.