Памела Кампос-Силва

1 Unidade de Pesquisa Urogenital, Centro Biomédico da Universidade Estadual do Rio de Janeiro, Бразилия

метаболитни

Анжелика Фуриел

1 Unidade de Pesquisa Urogenital, Centro Biomédico da Universidade Estadual do Rio de Janeiro, Бразилия

Валдемар С. Коста

1 Unidade de Pesquisa Urogenital, Centro Biomédico da Universidade Estadual do Rio de Janeiro, Бразилия

Франсиско Дж. Б. Сампайо

1 Unidade de Pesquisa Urogenital, Centro Biomédico da Universidade Estadual do Rio de Janeiro, Бразилия

Bianca M. Gregório

1 Unidade de Pesquisa Urogenital, Centro Biomédico da Universidade Estadual do Rio de Janeiro, Бразилия

РЕЗЮМЕ

Предназначение:

Да се ​​оценят ефектите от различни диети с високо съдържание на мазнини върху телесната маса, въглехидратния метаболизъм и морфологията на тестисите при плъхове на възраст седем месеца.

Материали и методи:

Мъжки плъхове Wistar бяха разделени на четири групи: SC (стандартен чау), HF-S (диета с високо съдържание на мазнини, богата на наситени мастни киселини), HF-P (диета с високо съдържание на мазнини, богата на полиненаситени мастни киселини), HF-SP (диета с високо съдържание на мазнини) богата на наситени и полиненаситени мастни киселини). Плъховете са хранени в продължение на 16 седмици. За анализ бяха събрани кръвни проби, тестиси и генитални мастни натрупвания. Данните бяха анализирани чрез еднопосочен ANOVA и Bonferroni post hoc тест, като се вземе предвид p Ключови думи: Затлъстяване, мастни киселини, ненаситени, мастни киселини, тестиси, плъхове, Wistar

ВЪВЕДЕНИЕ

Световната здравна организация (СЗО) изчислява, че повече от половин милиард възрастни са със затлъстяване и приблизително три милиона души умират в резултат на затлъстяване годишно (1). Известно е, че излишъкът от прием на липиди, независимо от вида на мазнините, причинява затлъстяване. Затлъстяването обикновено се свързва с по-висока честота на инсулинова резистентност, захарен диабет тип 2, хипертония, дислипидемия, някои видове рак и някои метаболитни и репродуктивни нарушения (2).

През последните години няколко проучвания показват обратна връзка между индекса на телесна маса (ИТМ) и хиперлептинемия при репродуктивните параметри на мъжете. При затлъстелите мъже лептинът може да действа и за понижаване на нивото на тестостерон, което предполага хипогонадизъм (3). Богатите на мазнини диети влияят върху организацията на плазмената мембрана. Една от последиците в тестисите е променената наличност на гонадотропинови рецептори, като лутеинизиращ хормон (LH) и фоликулостимулиращ хормон (FSH), включваща производството на тестостерон от клетките на Leydig (интерстициален) и сперматогенезата от клетките на семенните тубули, съответно (4).

Има малко данни относно ефектите на наситените и полиненаситените мастни киселини върху компонентите на тестисите при плъхове. Целта на настоящото проучване беше да се оцени телесната маса, въглехидратния метаболизъм и морфологията на тестисите при плъхове Wistar на седем месеца, хранени с различни диети с високо съдържание на мазнини (богати на наситени и/или полиненаситени мастни киселини).

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Експериментален протокол

Това проучване е одобрено от Комитета по етика за грижа и използване на експериментални животни от Института по биология, CEUA0272012) и следва насоките, предложени от Бразилския колеж за експериментиране с животни (COBEA).

Мъжки плъхове Wistar на възраст три месеца бяха разделени на четири експериментални групи според съдържанието на липиди в диетата им: SC (стандартен чау, n = 9), HF-S (диета с високо съдържание на мазнини, богата на наситени мастни киселини, на база свинска мас, n = 10), HF-P (диета с високо съдържание на мазнини, богата на полиненаситени мастни киселини, на базата на масло от рапица, n = 10) и HF-SP (диета с високо съдържание на мазнини, богата на наситени и полиненаситени мастни киселини, n = 10). SC диетата (14% протеини, 76% въглехидрати и 10% липиди с обща енергия 15,9 kJ/g) и различните диети с високо съдържание на мазнини (14% протеини, 36% въглехидрати и 50% мазнини с обща енергия 20,9 kJ/g) бяха приготвени в съответствие с препоръките на AIN-93M (5). Диетите са направени от Pragsolutions® (www.pragsolucoes.com.br), а диетите с високо съдържание на мазнини включват добавена свинска мас (наситена мастна киселина) и/или масло от рапица (полиненаситени мастни киселини).

Контролната и СН групата получиха диетите SC, HF-S, HF-P и HF-SP в продължение на 16 седмици, от три месеца до седеммесечна възраст. Приемът на храна се записва ежедневно. Телесната маса (BM) се проследява ежеседмично до края на експеримента. Животните бяха поставени в подходяща среда с температура 21 ± 2 ° C и контролиран светлинен цикъл (12-12 h светло/тъмно), със свободен достъп до вода и храна.

Евтаназия на животни

След 12 часа на гладно животните се анестезират интраперитонеално с натриев пентобарбитал и се убиват на седеммесечна възраст. Кръвни проби бяха събрани от сърцето (дясното предсърдие) чрез сърдечна пункция за серумен анализ. Тестисите и гениталната мастна подложка бяха дисектирани, претеглени и фиксирани.

Серумна биохимия и хормонални нива

Серумът се отделя чрез центрофугиране (3000 rpm, в продължение на 8 минути) при стайна температура и се съхранява при -20 ° C за серумния анализ. Концентрациите на глюкоза (монореагент-К082), триглицериди (монореагент-К117) и общ холестерол (монореагент-К083) са измерени чрез колориметричен анализ (Bioclin Systems II®, Quisaba, Bioclin, Belo Horizonte, MG, Бразилия). Серумните анализи за инсулин, лептин и тестостерон са извършени, като се използват следните налични в търговската мрежа ензимно-свързани имуносорбентни тестове (ELISA): инсулинов комплект за плъх/мишка (Millipore-Cat. EZRMI-13 k - St Charles, MO, USA), плъх комплект за лептин (Millipore-Cat. EZRL-83K, St Charles, MO, USA) и общ комплект за тестостерон (Uscn-Cat. E90458Ge - Ухан, Китай). Всички проби бяха анализирани в два екземпляра с коефициент на вариация в рамките на анализа от 1,4%.

Имунохистохимия

Секции на тестисите с дебелина 5 μm бяха депарафинизирани и извличането на антиген беше извършено с TRIS-EDTA (рН 9.0) в продължение на 12 часа (цяла нощ) при 60 ° C. След това беше направена ендогенна пероксидазна блокада с водородна пероксидаза 3% и неспецифичното свързване беше инхибирано. Секциите бяха инкубирани с анти-PCNA антитяло (PC10, Ref: 180110, Invitrogen, Camarillo, CA, USA), а имунореакцията беше усилена със системния комплект биотин-стрептавидин (Ref: 859643, Invitrogen, Frederick, MD, USA) . Имунооцветяването се визуализира след инкубация на срезите с 3,3-диаминобензидин тетрахлорид (Ref: 859643, Invitrogen, Frederick, MD, USA) и противооцветяване с хематоксилин на Mayer.

Количествено изследване на тестисите

Тестисите бяха фиксирани в разтвор на Bouin за 24 часа и 1,27 М формалдехид в 0,1 М фосфатен буфер, рН 7,2 за 48 часа при стайна температура, след като бяха вградени в Paraplast plus® (Sigma – Aldrich C., St. Louis, MO, USA ). Впоследствие материалът се разрязва с дебелина 5 μm и се оцветява с хематоксилин и еозин. Цифровите изображения от тестисите са получени чрез светлинен микроскоп Olympus BX51 (Токио, Япония), свързан с цифров фотоапарат (Olympus DP70-Токио, Япония). Количествената оценка е извършена с помощта на софтуера Image J® (Обработка и анализ на изображения в Java). След калибриране диаметърът на семенните тубули и височината на семенния епител се определят с инструмента за избор на прави линии. Тези морфометрични анализи са извършени с 10Х обектив за диаметъра на семенните тубули и 20Х обектив за височината на семенния епител. Скоростта на клетъчна пролиферация се измерва с инструмента „клетъчен брояч” и след това се използва инструментът „избор на свободна ръка” за определяне на количествено определената площ. Фотомикрографиите са получени с използване на обектив 40X. За тези анализи бяха оценени и 25 полета/животно.

Биохимичен анализ

Пробите се фиксират в студен ацетон за 24 часа при 4 ° С. След това материалът се разцепва (2 mm x 2 mm) и се подлага на две накисвания за 24 часа, всяко в 40 ml хлороформ/метанол (2: 1, v/v) при стайна температура. Материалът се инкубира при 60 ° С в продължение на 30 минути. По този начин, 5 до 15 mg тестикуларна суха тъкан се обезмасляват и хидролизират в 6N HCI в продължение на 18 часа при 118 ° С. Дозировката се определя с помощта на неутрализирани хидролизати по метода на хлорамин Т (6).

Анализ на данни

Данните се отчитат като средно ± стандартно отклонение (SD). Разликите между групите се изчисляват чрез дисперсионния анализ (еднопосочен ANOVA) и Bonferroni post hoc тест. Във всички случаи р-стойност ≤ 0,05 се счита за статистически значима (GraphPad Prism версия 5.03 за Windows – GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния, САЩ).

РЕЗУЛТАТИ

Прием на храна и телесна маса

маса 1

Серумни анализиSC (n = 9) HF-S (n = 10) HF-P (n = 10) HF-SP (n = 10)
Глюкоза (mmol/L)7,87 ± 1,6210,62 ± 2,36 а 9,85 ± 1,6111,09 ± 1,65 a
Инсулин (µLU/ml)1,49 ± 0,412,75 ± 0,45 a 2,15 ± 0,832,85 ± 0,92 a
Триглицериди (mg/dL)86,29 ± 23,6895,63 ± 8,6083,63 ± 17,5284,25 ± 5,04
Общ холестерол (mg/dL)80,56 ± 11,75104,80 ± 12,95 a 100,10 ± 10,38105,20 ± 19,65 a
Лептин (ng/ml)6,79 ± 3,7312,04 ± 1,02 a 11,49 ± 1,73 a 11,63 ± 1,61 a
Тестостерон (ng/ml)5,48 ± 0,834,73 ± 1,144,28 ± 1,255,11 ± 0,89
Параметри на тестисите SC (n = 9)HF-S (n = 10)HF-P (n = 10)HF-SP (n = 10)
Маса на тестисите (g)1,46 ± 0,091,51 ± 0,071,52 ± 0,071,53 ± 0,08
Височина на семенния епител (µm)44,84 ± 1,4641,66 ± 2,60 a 46,12 ± 2,24 b 44,92 ± 1,92 b
Диаметър на семенните каналчета (µm)310,60 ± 6,99303.30 ± 8.26297,90 ± 10,15291,40 ± 11,46 a
Клетъчна пролиферация (µm/mm 2)3,24х10 -3 ± 0,83х10 -3 2,25х10 - 3 ± 0,57х10 -3а 2,89x10 3 ± 0,23x10 -3 2,75x10 3 ± 0,36x10 -3
Колаген (µg/mg)2,09 ± 0,232,08 ± 0,211,94 ± 0,682,07 ± 0,37

Липиден профил, нива на лептин и тестостерон

Стойностите на общия холестерол са по-високи в групите HF-S и HF-SP, отколкото в групата SC (p = 0,0021). Всички животни, получили HF диети, са показали хиперлептинемия (p = 0,0019). Нивата на триглицеридите и тестостерона не се различават между групите (Таблица-1).

Параметри на тестисите

Масата на тестисите не се различава между групите. Фигура-1 показва височината на семенния епител и диаметъра на семенните тубули, а Фигура-2 показва пролиферацията на сперматогенна клетъчна линия в тестисите на различните групи. Групите SC, HF-P и HF-SP показват най-висок семенни епители в сравнение с групата HF-S (p = 0,0003). По отношение на диаметъра на семенните тубули се наблюдава намаляване в HF-SP групата в сравнение с SC групата (p = 0,0010). Клетъчната пролиферация е намалена в HF-S група в сравнение с SC групата (р = 0,0450). Нивото на колаген не се различава между групите (Таблица-1).