Дарлайн Гарибай

1 Катедра по биомедицински науки, Университет Корнел

гастректомия

Бетани П. Къмингс

1 Катедра по биомедицински науки, Университет Корнел

Резюме

Въведение

Тъй като епидемията от затлъстяване продължава да нараства в световен мащаб, бариатричната хирургия придоби популярност, тъй като е най-ефективното дългосрочно лечение на затлъстяването1. За съжаление загубата на тегло чрез диета и упражнения е трудно постижима и относително неефективна в дългосрочен план2,3. Бариатричната хирургия, като гастректомия с вертикален ръкав (VSG), се определя като манипулация на стомашно-чревния тракт с цел отслабване1,4. Въпреки че загубата на тегло е виден резултат от бариатричната хирургия, бариатричната хирургия осигурява други ползи за здравето, като подобряване на съпътстващите заболявания при затлъстяване и удължаване на живота5. Например, бариатричната хирургия води до високи нива на ремисия на диабет тип 2 и хипертония, както и до намаляване на доживотния риск от развитието на някои видове рак1,6,7. Трябва да се отбележи, че ефектът от бариатричната хирургия, причиняваща ремисия на диабет тип 2 и хипертония, често се наблюдава скоро след операцията и преди загуба на тегло8,9. Това подчертава концепцията, че съществуват механизми, независими от телесното тегло, допринасящи за ползите за здравето, наблюдавани след операцията. Разработени са животински модели на бариатрична хирургия, които се използват за изследване на механизмите, чрез които се получават тези ползи за здравето10,11,12.

Утвърдихме миши модел на VSG, който приложихме към различни генетично модифицирани миши модели, за да проучим механизмите, чрез които бариатричната хирургия подобрява съпътстващите заболявания на затлъстяването като диабет тип 2, хипертония и колоректален рак10,11,12. Моделите на гризачи позволяват по-експериментален контрол и способността да се извършват генетични или фармацевтични манипулации, за да се определи ролята на специфични гени или сигнални пътища от интерес. Ние се фокусираме основно върху VSG, тъй като VSG е най-често извършваната бариатрична процедура в клиниката в Съединените щати13. Освен това, VSG е прост хирургичен модел с по-малко анатомични модификации в сравнение с други процедури като стомашен байпас на Roux-en-Y или билиопанкреатична диверсия.

Нашият модел на мишка на VSG рекапитулира следните ефекти от бариатричната хирургия, наблюдавани при хора: загуба на тегло, намален прием на храна, подобрена регулация на глюкозата, подобрена функция на островчета, повишена секреция след глюкагон-подобен пептид-1 (GLP-1), намалена артериална кръвно налягане и повишени концентрации на циркулираща жлъчна киселина 10,11,12,13,14,15. Следователно, това е идеален модел за изследване на зависими от телесното тегло и независими механизми, чрез които VSG подобрява или разрешава съпътстващите заболявания при затлъстяване. В допълнение, това е надежден модел, който може да се комбинира с други хирургични процедури, позволявайки да се изследва въздействието на VSG при различни болестни състояния с по-голяма механистична проницателност12.

Протокол

Всички експериментални протоколи са одобрени от институционалния комитет по грижа и употреба на животните в университета Корнел.

1. Предхирургична подготовка

ЗАБЕЛЕЖКА: Изследваните мишки обикновено са на фона на затлъстяване, предизвикан от диета C57BL, за да направят проучванията транслационно значими за човешкото затлъстяване и инсулиновата резистентност. Мъжки и женски мишки могат да бъдат изследвани, както е описано в следващите стъпки.

На възраст от 2 месеца поставете мишки на 45% или 60% диета с високо съдържание на мазнини за 2 месеца (вж Таблица на материалите). ЗАБЕЛЕЖКА: Мишките се хранят с високо съдържание на мазнини, за да създадат затлъстяване и резистентност към инсулин. В зависимост от целите на изследването могат да се използват по-кратки или по-дълги периоди на хранене с високо съдържание на мазнини.

Продължете да храните мишки ad libitum до операция. Ако са необходими измервания на изходно ниво, след 7 седмици хранене с високо съдържание на мазнини, бързи мишки в продължение на 6 часа или за една нощ и вземете изходна кръвна проба за измерване на метаболитите, които представляват интерес (напр. Глюкоза).

Продължете да мишите на диета с високо съдържание на мазнини и оставете мишките да се възстановят една седмица след вземането на кръв преди фалшива операция или VSG. Поставете мишките на течна диета (вж Таблица на материалите) в продължение на 4 дни преди операцията. ЗАБЕЛЕЖКА: Мишките се поддържат на течна диета преди и след операцията, за да изчистят храносмилателния тракт от частици, които могат да влошат лечебния отговор.

Стерилизирайте следните артикули преди операцията: фолио, марля, апликатори с памучен връх (CTA) и хирургически инструменти (хемостат, операционна ножица, ножица на ириса, формован форцепс, назъбена щипка на Браун-Адсън, игла за сонда, игла за микроигла, пружинна ножица).

2. Процедури за вертикална ръкавна гастректомия и фиктивни процедури

В деня на операцията претеглете мишки, за да получите измерване на изходното тегло.

Оборудвайте хирургичната зала със система за анестезия, нагрята водна баня и подгряваща подложка. Поставете водната баня на 37 ° C и я използвайте за затопляне на 0,9% физиологичен разтвор за напояване. Почистете хирургичното поле със 70% етанол и използвайте стерилна техника, за да отворите автоклавирана хирургическа опаковка и инструменти. ЗАБЕЛЕЖКА: Нагревателната подложка се използва за поддържане на топлината на животното по време на операция и възстановяване след анестезия.

Използвайки индукционна камера, анестезирайте мишката с 5% изофлуран и дебит на O2 от 1 L/min. Потвърдете, че мишката е в подходящата равнина на анестезия, като извършите щипка на пръста. Поддържайте мишката с 1-3% изофлуран и дебит на O2 от 0,6 L/min, след като се постигне постоянна равнина на анестезия.

След като мишката е обезболена, поставете очен мехлем (вж. Таблица на материалите) върху очите й, за да ги поддържате влажни по време на операцията. По това време се прилага и аналгетик, като мелоксикам (2 mg/kg подкожно). Закрепете косата от пъпа към аксилата, като държите кожата внимателно надолу, за да осигурите напрежение.

Тъй като кожата на мишката е тънка и нежна, внимавайте да не причинявате кожни лезии, когато подстригвате косата. Почистете кожата с повидон-йод и алкохол.

Надейте стерилни ръкавици и подгответе стерилното хирургично поле и инструменти. Извършете останалата част от процедурата, като използвате стерилна техника. Подгответе стерилното хирургично поле, като поставите стерилни хирургически завеси от двете страни на мишката. Използвайте автоклавирано калаено фолио, за да създадете хирургическа завеса за мишката.

Изрежете малка дупка в калаеното фолио, за да позволите достъп до корема на мишката.

Направете разрез на кожата от средата на корема (пъпката) до нивото на мечовидния хрущял с помощта на ножица за ирис. Идентифицирайте linea alba и използвайте ножица за ирис, за да прорежете стената на тялото по линия linea alba. Използвайте CTA за леко повдигане на стомаха от корема и след това направо дисекция на по-големия омент от по-голямата кривина на стомаха.

Лигирайте късата стомашна артерия, която минава между дъното на стомаха и далака, като поставите две лигатури, използвайки 7-0 монофиламентен абсорбиращ шев. Използвайте пролетни ножици, за да разрежете между двете лигатури. След като артерията бъде трансектирана, напълно екстериоризира стомаха от коремната кухина. Поставете марля под стомаха и намокрете с физиологичен разтвор, за да поддържате тъканта влажна.

Фиктивна процедура

За фиктивната процедура поставете хлабав прост непрекъснат шаблон на шева, като използвате 6-0 абсорбиращ се шев с нишки с конусна игла. Започнете 2 mm вдясно (отдясно на хирурга) от хранопровода. Поставете линията на шева по вентралната стомашна стена и след това продължете по гръбната стомашна стена. ЗАБЕЛЕЖКА: За всички стомашни манипулации използвайте само монофиламентен абсорбиращ шев, за да намалите риска от инфекция. Освен това, използвайте само шев с конусна игла за всички стомашни манипулации, тъй като използването на режеща игла увеличава риска от "изтегляне" на шева, което води до увреждане на стомашната тъкан и отслабване на раната.

Прекарайте иглата напълно през една стомашна стена, докато поставяте шева. Уверете се, че шевът лежи плоско, но не ограничава стомаха. Внимателно завържете шева с 3-4 хвърляния и преминете към стъпка 2.9.

За процедурата VSG пропуснете стъпка 2.7 и продължете със стъпка 2.8.

VSG процедура

За процедурата VSG, лигирайте изпъкналите клонове на стомашната артерия и вена със 7-0 абсорбиращ се монофиламен шев с конусна игла, като използвате 3 хвърляния за всеки възел. Поставете лигатурите точно под (т.е. към по-малката кривина на стомаха) предвидената линия на трансекция. ЗАБЕЛЕЖКА: Предвидената линия на трансекция започва от

2 mm по-горе (което означава по-голямата кривина на стомаха) сърдечната изрезка на стомаха и най-малко 2 mm под margo pilcatus и се простира до проксималния край на десния лоб на панкреаса. Обикновено има 4 съда на стомашна стена, които трябва да се лигират; това обаче може да варира при мишките.

За да предотвратите разтичане на стомашно съдържимо по време на гастректомия, поставете обикновена непрекъсната линия на шева, минаваща през двете стомашни стени, точно под предвидената линия на трансекция, използвайки 6-0 монофиламентен абсорбиращ шев с конусна игла. Започнете шевната линия вдясно от хирурга на хранопровода и под марго пикатус и завършете точно над панкреаса.

Поставете хемостатици с тънък връх над линията на шева и използвайте пролетни ножици, за да разрежете между линията на шева и хемостатите. Отстранете трансектираната стомашна тъкан от стерилното хирургично поле. Използвайте CTA за почистване на кръвта и храносмилането на стомаха.

Подсилете поставянето на стомашните стени с помощта на 6-0 монофиламентен абсорбиращ шев с конусна игла, използвайки прост прекъснат модел. ЗАБЕЛЕЖКА: Препоръчва се обикновен прекъснат шев, тъй като това осигурява по-сигурно затваряне от простия непрекъснат шев.

Промивайте стомашния остатък с физиологичен разтвор по време на процедурата, за да поддържате тъканта влажна и чиста. Използвайте 20G игла за сонда, прикрепена към 20 ml спринцовка, за да извършите стомашна промивка с физиологичен разтвор. Използвайте този размер, за да сте сигурни, че се осигурява адекватно налягане, без да рискувате увреждане на стомашната тъкан от прекомерно налягане или случайно увреждане на стомашната тъкан от използването на обикновена заострена игла.

Използвайте минимум 20 възела за сигурно затваряне на стомаха; обърнете внимание на затварянето по дължината на хранопровода, тъй като тази страна е по-трудна за достъп и поради това често е място на дехисценция.

Уверете се, че няма течове, като внимателно натискате стомаха с CTA. Ако се установят течове, поставете допълнителни прости непрекъснати възли върху зоните на течове и след това тествайте отново. Тест за течове, докато не се открие изтичане.

Направете окончателна промивка на стомаха, като използвате поне 60 mL физиологичен разтвор, за да сте сигурни, че няма оставени инфекциозни частици.

Поставете стомаха обратно в коремната кухина под черния дроб с помощта на CTA. Поставете CTA по дорзалния аспект на коремната кухина, за да абсорбира цялата излишна течност. С помощта на тъп 18G игла инжектирайте лактиран разтвор на Рингер (LRS) със или без антибиотици (0,5 ml LRS +/- 20 mg/kg енрофлоксацин) директно в коремната кухина, непосредствено преди затварянето. ЗАБЕЛЕЖКА: Това замества загубата на течности, получена по време на операцията, и осигурява метод за директно прилагане на антибиотици към мястото на хирургията, за да помогне за възстановяване.

Затворете коремния мускулен слой, като използвате 6-0 абсорбиращ се монофилен шев с конусна игла в прост прекъснат модел. След това затворете кожния слой с 6-0 монофиламентен абсорбиращ шев по прост непрекъснат модел.

Поставете лепило за тъкани върху кожата и сгънете кожата над линията на шева, за да погребете шева, така че мишката да не може да наруши затварянето на раната след операцията.

Изключете изофлурана и оставете мишката да се възстанови върху нагревателната подложка за 10-15 минути, преди да го върнете в домашната си клетка. Не оставяйте животното без надзор, докато то не дойде в съзнание и не е в състояние да се движи.

Дръжте животните настанени поотделно, докато се възстановят напълно от операцията. ЗАБЕЛЕЖКА: Ако по време на проучването трябва да се получат точни измервания на приема на храна, мишките трябва да продължат да бъдат настанявани поотделно през цялото проучване. Съществува риск от запушване на чуждо тяло от яденето на спално бельо за домашни клетки. Животните трябва да бъдат настанени в клетки, свободни от постелки, с изключение на материал за гнездене, за да се осигури обогатяване (вж Таблица на материалите).

3. Постоперативни грижи и измервания на мишки

Върнете мишката в домашната клетка и поставете клетката върху нагревателна подложка. Поддържайте мишките на течна диета поне 7 дни след операцията. Прилагайте аналгетик, като мелоксикам (2 mg/kg подкожно), в продължение на 2 дни след операцията. ЗАБЕЛЕЖКА: Антибиотик, като енрофлоксацин (20 mg/kg), може да се прилага до 7 дни след операцията. Дават се антибиотици, за да се сведе до минимум рискът от инфекция от хирургичната процедура и може или не може да се наложи в зависимост от нивото на стерилитет, поддържано по време на процедурата. Ако обаче се използват антибиотици, те трябва да се прилагат на всички мишки в едно и също проучване, за да се поддържа последователност.

По време на следоперативния период оценявайте телесното тегло, приема на храна, дефекацията, нивото на активност и разположението поне всеки ден, за да осигурите правилното излекуване и възстановяване. Провеждайте следоперативно наблюдение в продължение на 14 дни след операцията. ЗАБЕЛЕЖКА: Хирургичната недостатъчност обикновено се наблюдава или веднага след операцията, или в рамките на три дни след операцията. Животните, които не ядат и не пият на втория ден след операцията, трябва да бъдат внимателно наблюдавани за хирургични усложнения.

След успешно приключване на следоперативния период, измервайте редовно телесното тегло и приема на храна през цялото проучване, за да осигурите поддържане на подходящия фенотип.

Направете орален тест за глюкозен толеранс (OGTT), за да оцените глюкозния толеранс, стимулираната от глюкоза секреция на инсулин и секрецията на чревния хормон.

Извършете OGTT на мишки след гладуване в продължение на 6 часа и след това извадете мишки с 50% разтвор на декстроза в доза от 1 g/kg.

Вземете кръвни проби от опашката на 0, 2,5, 5, 15, 30, 60 и 120 минути след сондата. Измервайте кръвната глюкоза с глюкомер в тези часови точки. Вземете проби от серум във всеки момент от време за измерване на различни хормони, като инсулин и GLP-1.

Бързи мишки за 6 часа преди евтаназия. Вземете окончателна кръвна проба и измерване на глюкозата. Сравнете крайното измерване на глюкозата с измерването на изходното ниво. Евтаназирайте мишки с интраперитонеална инжекция на пентобарбитал в доза от 200 mg/kg.

Използвайте изходните и крайните серумни проби за измерване на допълнителни анализи и сравняване на пред- и следоперативни хирургични стойности.

Представителни резултати

Фиктивните и VSG процедурите са изобразени на фигура 1. Фигура 1А показва къде шевната линия е поставена по протежение на стомашните стени по време на фиктивната процедура. Същата тази област е мястото, където стомаха се реже по време на VSG операция. Фигура 1В показва тръбния остатък на стомаха, останал след изпълнение на VSG.