Допринесе еднакво за тази работа с: Alison E. Harvey, Laura M. Lashinger

растежа

Отделение за хранителни науки, Тексаски университет, Остин, Остин, Тексас, Съединени американски щати

Допринесе еднакво за тази работа с: Alison E. Harvey, Laura M. Lashinger

Отделение за хранителни науки, Тексаски университет, Остин, Остин, Тексас, Съединени американски щати

Отделение за хранителни науки, Тексаски университет, Остин, Остин, Тексас, Съединени американски щати

Отделение за хранителни науки, Тексаски университет, Остин, Остин, Тексас, Съединени американски щати

Отделение за хранителни науки, Тексаски университет, Остин, Остин, Тексас, Съединени американски щати

Отделение за молекулярна канцерогенеза, Университет на Тексас, Център за рак на Андерсън, Смитвил, Тексас, Съединени американски щати

Отдел по хранителни науки, Тексаски университет, Остин, Остин, Тексас, Съединени американски щати, Департамент по молекулярна канцерогенеза, Университет на Тексас, Център за рак на Андерсън, Смитвил, Тексас, Съединени американски щати

  • Алисън Е. Харви,
  • Лора М. Лашингер,
  • Дрю Хейс,
  • Лорън М. Харисън,
  • Кимбърли Луис,
  • Сюзън М. Фишер,
  • Стивън Д. Хърстинг

Фигури

Резюме

Цитат: Harvey AE, Lashinger LM, Hays D, Harrison LM, Lewis K, Fischer SM, et al. (2014) Ограничението на калориите намалява растежа на миши и човешки панкреатични туморни клетки, активиране на ядрен фактор-кВ и свързана с възпаление генна експресия при инсулиноподобен фактор на растеж-1 - зависим начин. PLoS ONE 9 (5): e94151. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0094151

Редактор: Lucia R. Languino, Университет Томас Джеферсън, Съединени американски щати

Получено: 16 ноември 2013 г .; Прието: 11 март 2014 г .; Публикувано: 7 май 2014 г.

Финансиране: Това проучване беше подкрепено от безвъзмездните средства на Националните здравни институти (NIH), R01 CA135386, присъдени на S.D. Хърстинг и С.М. Финансирани и финансирани от NIH постдокторски стипендии, R25T CA57730 и T32 CA135386, присъдени на Л. М. Лашингер. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Ракът на панкреаса е четвъртата водеща причина за свързана с рак смърт в Съединените щати [1], с 5-годишна преживяемост от едва 3–5% [2]. Последните епидемиологични проучвания показват, че затлъстяването е свързано с 2 пъти по-висок риск от рак на панкреаса както при мъжете, така и при жените [3]. Освен това, 10 проспективни кохортни проучвания също съобщават за повишен риск от рак на панкреаса при затлъстели индивиди с индекс на телесна маса (ИТМ)> 30 в сравнение със здрави индивиди с ИТМ от 5 Panc02 миши панкреатични аденокарциномни клетки (щедро предоставени от д-р J Schlom, NCI, реф. [34]) в десния фланг, след което продължават да спазват режимите на диета и растежът на тумора се наблюдава още 5 седмици. Туморите се палпират и измерват с дебеломери Vermeer седмично и обемът на тумора се изчислява, използвайки формулата 4/3∏ (r1) 2 (r2). След 5 седмици на туморен растеж, мишките бяха на гладно в продължение на 12 часа, анестезирани с изофлуран за събиране на кръв чрез сърдечна пункция, след което умъртвени от цервикална дислокация. Туморите се изрязват и претеглят, след това се замразяват в течен азот и се съхраняват при -80 ° C или се фиксират в 10% неутрално буфериран формалин за една нощ, след което се превключват на етанол, докато се обработят и се влее парафин.

При подготовката за инжектиране, клетките Panc02, получени от химически индуциран аденокарцином от степен II (Corbett et al, 1984), се поддържат в инкубатор при 37 ° C в атмосфера от 5% CO2 с модифицирана среда с висока глюкоза на McCoy 5A (Invitrogen, Carlsbad, Калифорния), допълнена с 10% фетален говежди серум (FBS; Hyclone), 2 mM глутамин (Invitrogen), 10 000 U/ml пеницилин, 10 000 U/ml стрептомицин, 1X несъществени аминокиселини, 10 mM HEPES буфер и 1 тМ натриев пируват.

MiaPaCa-2 проучване за трансплантация на човешки тумор на панкреас при хора.

Тридесет и 6-седмични мъжки атимични голи мишки бяха закупени от лаборатории Jackson (Bar Harbor, ME) и поставени на диета за чау в продължение на 1 седмица след пристигането в UT Austin Animal Resource Center. Мишките (n = 15/група) са рандомизирани да получават или контролна диета, или 30% CR диета, използвана в предишното проучване. Животните бяха настанени поотделно и получиха диета в продължение на 23 седмици. Средното телесно тегло на диетична група е регистрирано за 16 седмици (1 седмица преди инжектиране на туморни клетки). На 17-та седмица от диетичното лечение, мишките бяха инжектирани подкожно с 4 × 106 6 човешки ракови клетки на панкреаса на MiaPaCa-2 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA) в десния фланг. Растежът на тумора се проследява и записва, както е описано по-рано в продължение на още 6 седмици. След това мишките се гладуват в продължение на 12 часа, анестезират се с изофлуран, след което се убиват при дислокация на шийката на матката. Туморите се изрязват и претеглят, след което се приготвят, както е описано по-горе. Пълна кръв също е събрана и приготвена, както е описано по-горе. Една мишка от всяка група не е развила никакви тумори, така че са били изключени от анализа, така че крайният размер на пробата е 14.

Преди инжектирането клетките на MiaPaCa-2 се поддържат в DMEM с 10 000 U/mL пеницилин, 10 000 U/mL стрептомицин, 1Х несъществени аминокиселини, 10 mM HEPES буфер и 1 mM натриев пируват.

Анализ на серумен маркер

За проучването за трансплантация Panc02 кръв се събира след 21 седмици на диета и се анализира за циркулиращи нива на инсулин, лептин, адипонектин и MCP-1, които са измерени с помощта на мултиплексирани тестове на базата на зърна Lincoplex (Millipore Corporation, Billerica, MA) върху анализатор BioRad Bioplex 200 (BioRad, Hercules, CA) според указанията на производителя. Нивата на серумен IGF-1 също бяха анализирани в този момент от ELISA съгласно инструкциите на производителя (Quantikine MG-100, R&D Systems, Minneapolis, MN). Размерът на пробата за анализ на всеки аналит е осем произволно избрани мишки на група. По време на крайната точка на проучването (26 седмици на диета), кръвната глюкоза на гладно се измерва на крайни кръвни проби, като се използва глюкометър Contour с тест ленти за глюкоза Contour (Bayer HealthCare LLC, Mishawaka, IN Glucometer).

RT-PCR анализи в реално време на възпалителна, ангиогенеза и свързана с клетъчния цикъл генна експресия

Обща РНК беше извлечена от тумори Panc02 и MiaPaCa-2 с помощта на Qiagen RNeasy Mini Kit съгласно протокола на производителя (Qiagen, Калифорния). Общо 2 ug RNA бяха обърнати транскрибирани с помощта на комплекти за обратна транскрипция с cDNA с голям капацитет (Ambion, Austin, TX). Експресия на възпалителни, ангиогенни и свързани с клетъчния цикъл гени, включително F4/80, хемокин (CC мотив) лиганд (CCL) 2, S100A9, Ccdn1, Vegfa, Birc5, Ptgs2, IL-6, RELA (p65 субединица) и XIAP се определя чрез PCR в реално време, като се използват TaqMan праймер-сонди (Ambion, Austin, TX). Експресията на гени се нормализира към домакинския ген, β-актин и се анализира, използвайки метода ΔΔCT.

Имунохистохимично оцветяване на фосфо-p65 (p-p65)

Анализи на цитокини и хемокини в супернатанти от третирани с IGF-1 клетки

Panc02 клетки се засяват в 6 ямкови плаки в 10% добавена FBS среда за 24 часа. След четиричасово серумно гладуване, клетките се третират с IGF-1 (400 ng/ml; R&D системи) в продължение на 24 часа, след което се събира супернатант и се съхранява при -20 ° С, докато се извърши анализът. Нивата на експресия на протеини бяха анализирани, използвайки панел цитокин/хемокин на базата на топчета Lincoplex (Millipore Corporation, Billerica, MS) на анализатор BioRad Bioplex 200 (BioRad), съгласно указанията на производителя. Изборът на концентрация (400 ng/ml) се основава на физиологично значими нива на циркулиращ IGF-1, наблюдавани при мишки, хранени със същата контролна диета, използвана в настоящото проучване [35], [36], [37]. Супернатантите бяха събрани от три отделни експеримента.

Имунофлуоресценция на p65

NF-κB ДНК свързващ анализ

Приблизително 1 × 106 клетки Panc02 бяха засяти в 10 cm съдове, както е описано по-горе. Клетките се оставят да растат в стандартната DMEM + 10% FBS среда в продължение на 24 часа, след което серумът се гладува в продължение на 4 часа. След серумен глад, клетките бяха третирани с DMEM плюс 10% FBS, без серум DMEM или без серум DMEM + IGF-1 (400 ng/ml) в продължение на 4, 8 и 16 часа (данните не са показани) и протеин е събрана. Накратко, прикрепените клетки се измиват и събират в 1x PBS/фосфатазни инхибитори (Active Motif, Carlsbad, СА) и се центрофугират при 500 × g при 4 ° С. След отстраняването на супернатанта, клетъчната пелета беше ресуспендирана в приблизително 60–100 µl протеинов лизисен буфер (RIPA буфер, фосфатазен инхибитор II и III, Sigma; Roche MiniTab), държана на лед в продължение на 30 минути с леко разбъркване на всеки 10 минути, и се центрофугира при 16 000 × g за 10 минути при 4 ° С. Цялоклетъчните протеинови екстракти се определят количествено чрез анализ на Брадфорд (Bio-Rad; Hercules, CA) и се нормализират до говежди серумен албумин (BSA, 1 mg/ml).

Използван е TransAM ензимно свързан имуносорбентен анализ (ELISA) за измерване на активирането на субединицата NF-κB, р65, съгласно инструкциите на производителя (Active Motif, Carlsbad, CA). Накратко, 20 ug цял клетъчен протеинов лизат се разреждат в лизисен буфер (както е описано по-горе) и се зареждат на два екземпляра върху 96-ямкова плака, покрита с олигонуклеотид, съдържащ NF-κB консенсусно място (5′-GGGACTTTCC-3 '). Първично антитяло NF-кВ/р65 се добавя към всяка ямка и се използва за откриване на епитоп на NF-кВ, достъпен само когато се активира и се свърже с целевата му ДНК. Добавено е HRP-конюгирано вторично антитяло за генериране на колориметрична реакция, която се открива чрез спектрофотометрия при 450 nm с референтна дължина на вълната 655 nm. Тестовете бяха проведени върху три отделни експеримента.

NF-κB транскрипционно активиране

Приблизително 1,8 х 105 клетки Panc02 се посяват в 6-ямкови плаки и се оставят да се прикрепят за една нощ при 37 ° С. Двадесет и четири часа по-късно клетките бяха трансфектирани с pNF-κB/Luc и pRenilla/Luc (щедро предоставени от д-р Linda DeGraffenried), използвайки FuGENE6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Клетките се инкубират с трансфекционен агент за още 24 часа и след това серумът гладува в продължение на 4 часа. След серумен глад, клетките бяха третирани с McCoy's plus FBS, без серум McCoy's или IGF-1 (400 ng/mL) в продължение на 6 часа и белтъците бяха събрани с помощта на система за анализ на двойна луцифераза (Promega, Madison, WI) според производителя инструкции. Тестовете бяха проведени върху три отделни експеримента.

Малки интерфериращи РНК конструкции и трансфекции

Заглушаването на NF-κB беше постигнато чрез комбиниране на siRNA конструкции, насочени или към p65, или към разбъркана последователност (Ambion, Austin, TX) с Opti-MEM редуцирана серумна среда (Invitrogen; Carlsbad, CA) и siPORT Амин реагент за трансфекция (Ambion, Austin, TX) . Трансфекционният комплекс се добавя към клетките в 6-ямкова плака и се оставя да се инкубира цяла нощ. Двадесет и четири часа по-късно, среда, съдържаща трансфекционен комплекс, беше отстранена и клетките бяха гладувани от серум в продължение на 4 часа. След серумно гладуване, клетките се третират с McCoy's, допълнена с 10% FBS, без серум McCoy's или 400 ng/ml IGF-1 в продължение на 18 часа и РНК се събира за NF-κB анализ на гена надолу по веригата (както е описано по-горе).

Статистика

Данните за телесното тегло, телесните мазнини, кръвната глюкоза, обема на тумора и теглото са представени като средно ± SD, докато серумните хормони, PCR, експресията на супернатантния протеин, ELISA и репортерният анализ са показани като средно ± SEM. Различията в резултатите бяха анализирани чрез t-тест на Student, с изключение на разликите в експресията на гена Panc02 след третиране с IGF-1 със заглушителни конструкции, които бяха анализирани чрез еднопосочен ANOVA, последван от post hoc тест на Tukey. Различията във Vegf бяха оценени от T2 на Tamhane като post hoc тест поради неравномерна дисперсия). Данните се считат за значими, ако p Фигура 1. Състав на тялото, кръвната глюкоза и серумните фактори при мишки C57BL/6 след 21 седмично диетично лечение.

Ограничението на калориите (CR) намалява А, телесно тегло (съобщава се до 20 седмици при диети, преди инжектиране на туморни клетки); B, процент телесни мазнини (на 21 седмици на диета); и С, кръвна захар на гладно (при 21 седмици на диета) спрямо диетата CON (n = 15/група). Показаните данни представляват средна стойност ± SD. CR променени средни серумни нива на D на гладно, инсулин; E, IGF-1; F, лептин; и G, адипонектин (п = 8/група). Показаните данни представляват средна стойност ± SEM. * означава значителни разлики между CR и CON. CR, ограничение на калориите; CON, контролна диета; IGF-1, инсулиноподобен растежен фактор-1.

Серумният анализ на нивата на хормона и растежния фактор, реагиращи на енергийния баланс, разкрива, че след 21 седмици диетично лечение, инсулин на гладно (фиг. 1D), IGF-1 (фиг. 1Е) и лептин (фиг. 1F) са по-ниски в CR мишки в сравнение с контрола (p Фигура 2. CR намалява Panc02 обем на тумора и възпалителен профил.

CR намалява A, растеж на тумора и B, средно тегло на тумора в сравнение с CON мишки (n = 15/група). Показаните данни са средни ± SD, с изключение на линията в разпръснат график, представляваща средното тегло на тумора. C, CR намалява експресията на иРНК в микросредата на тумора в сравнение с CON мишки (CON, n = 6; CR, n = 5). Данните представляват CR генна експресия спрямо CON. D, Средни серумни нива на гладно на MCP-1 (n = 8/група, произволно избрана). E, Представителни микрографии на оцветяващи р-р65 туморни участъци (40Х). F, Количествено определяне на оцветяването. Стълбовидната диаграма представлява общия процент на p-p65-положителни клетки, с допълнителна илюстрация на вътреклетъчната локализация (ядрена, черна; цитоплазматична, бяла) (CON, n = 10 и CR, n = 7). Показаните данни представляват средна стойност ± SE. * означава значителни разлики между CR и CON. CR, ограничение на калориите; CON, контролна диета; MCP-1, моноцитен хемоаттрактант фактор-1; p-p65, фосфорилиран p65.

Анализът на възпалителната генна експресия показа, че туморите от CR мишки, спрямо контролите (n = 3 мишки/група), демонстрират 70% намаляване на експресията на гени, кодиращи възпалителните маркери, F4/80 и S100a9 (p Фигура 3. Ефект на IGF-1 върху p65 ядрена локализация и активиране на NF-κB път в клетки Panc02.

A, Представителни флуоресцентни изображения на p65 локализация в различни времеви точки след третиране с IGF-1 (400 ng/mL), използвайки 300 nM DAPI самостоятелно, p65 антитяло самостоятелно (p65) или p65 антитяло, оцветено с DAPI (обединено). Представител на данни за 4 отделни анализа. B, ELISA на p65 ДНК свързване в отговор на 4-часово третиране с IGF-1 (400 ng/mL). C, NF-кВ анализ на репортер на луцифераза след 6-часово третиране с IGF-1 (400 ng/mL). * означава значителни разлики между SF и IGF-1. D, PCR анализ на mRNA експресия на NF-κB надолу по веригата генни цели след 18-часово лечение с IGF-1. E, ELISA измерване на RANTES, LIF и VEGF (n = 3) експресия в Panc02 супернатант след 24 часа лечение с IGF-1. * означава значителни разлики между SF и IGF-1 по отношение на всеки съответен ген или протеин от интерес. Всички експерименти използват 400 ng/ml IGF-1. Стълбовидните графики представляват средна стойност ± SEM (n = 3 отделни експеримента, извършени в три екземпляра за B, C и D). SF, без серум; IGF-1, инсулиноподобен растежен фактор-1; DAPI, 4′-6-диамидино-2-фенилиндол; RANTES, Регламентирано за активиране, Нормални Т клетки, изразени и секретирани; LIF, инхибиторен фактор на левкемия; VEGF, съдов ендотелен растежен фактор.

Заглушаването на експресията на p65 минимизира индуцираната от IGF-1 генна експресия

Трансфекцията на Panc02 клетки с siRNA, специфична за p65, намалява p65-индуцираната генна експресия със 70–80% в рамките на 48 часа (p Фигура 4. Ефект на заглушен p65 върху IGF-1-индуцирана експресия на надолу по веригата NF-κB цели в Panc02 клетки.

A, Експресия на p65 mRNA в Panc02 клетки след излагане на или на разбъркана, или на p65-специфична малка интерферираща РНК. В, Ccdn1; Vegfa; Birc5; и експресия на COX-2 иРНК след 18-часово третиране с IGF-1 (400 ng/mL). Стълбовидните графики представляват средна стойност ± SEM (n = 3 отделни експеримента, извършени в три екземпляра за всеки ген). Различни букви или звездичка означават значението между групите. IGF-1, Инсулиноподобен растежен фактор-1.

CR намалява телесното тегло на MiaPaCa-2, туморната тежест и възпалителната генна експресия

Паралелно с нашите открития при мишки C57BL/6, контролната и CR диетите генерират два различни фенотипа с тегло при мъжки голи мишки с атимична фигура (фиг. 5А). CR мишките претеглят значително по-малко от мишките на контролна диета, започвайки след три седмици на диета (p Фигура 5. Диетични ефекти върху MiaPaCa-2 туморната тежест и генната експресия.