Резюме

Заден план

Модифицираната отвара Lingguizhugan (MLD) идва от известната китайска медицина Linggui Zhugan Decoction. MLD се използва за лечение на метаболитен синдром в клинични условия. Нашето проучване се фокусира върху цялостното лечение на MLD, включено с диетични ограничения и упражнения в модел на метаболитен синдром (MS) при плъхове.

Методи

Плъховете бяха разделени на пет групи: контролна група (Cont), диетична група с високо съдържание на мазнини (HFD), диета с високо съдържание на мазнини, включена с диетична ограничителна група (HFD-DR), упражнения, включени с диетична ограничителна група (HFD-DR-Ex) и MLD, включени с диетични ограничения и група за упражнения (HFD-DR-Ex-MLD). Лечението се провежда в продължение на 1 седмица след хранене с високо съдържание на мазнини в продължение на 12 седмици. Бяха изследвани ефектите от лечението върху затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини, хипергликемия, хиперлипидемия, хипертония, чернодробно увреждане и инсулинова резистентност при плъхове с МС. В допълнение, туморният фактор на некроза-α (TNF-α), лептинът и протеин киназата B (PKB) в серума и черния дроб на плъховете също са изследвани чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA).

Резултати

След седмична интервенция чрез диетични ограничения, диетични ограничения, включени с упражнения или MLD, в сравнение с HFD плъхове, относителното тегло на черния дроб и мазнините, нивата на триглицеридите, общия холестерол, липопротеините с ниска плътност, свободната мастна киселина, аспартат аминотрансферазата, глутамин- пирувичната трансаминаза и алкалната фосфатаза, инсулин, са значително намалени (стр

Заден план

Метаболитният синдром (MS) е хронично заболяване на системното разстройство, характеризиращо се с коремно затлъстяване, абнормен метаболизъм на глюкозата, нарушения на липидите в кръвта, високо кръвно налягане и сърдечно-съдови заболявания [1, 2]. МС е водеща причина за смъртност и заболеваемост в индустриализираните страни [3]. В САЩ националните проучвания показват, че разпространението на МС е 23,7% сред общата популация [4]. В Китай проучване сред 35–74-годишни възрастни показва, че разпространението на МС е съответно 10,0 и 23,3% при мъжете и жените [5].

МС е заболяване, съставено от различни рискови фактори като затлъстяване, диабет тип 2 или дислипидемия. Разпространението на този синдром се увеличава в световен мащаб успоредно с нарастването на затлъстяването и показва, че трябва да му се обърне по-голямо внимание [6]. Понастоящем затлъстяването е световна пандемия и се очаква да засегне 10% от глобалното население до 2030 г., ако се запази настоящата тенденция [7]. Затлъстяването е резултат от дисбаланс между приема на калории и енергийните разходи, което води до излишък на енергия, която се съхранява като мазнини главно в бялата мастна тъкан [8]. Всеизвестно е, че неподходящата диета и бездействието са важни фактори, определящи МС и други хронични заболявания. Диетичните ограничения и упражненията привличат вниманието през последните години поради ефекта му върху загубата на тегло за намаляване на рисковите фактори за сърдечно-съдови заболявания при пациенти със затлъстяване [9]. Клинични и експериментални доказателства показват, че ограничаването на диетата и упражненията могат да бъдат много ефективна стратегия за предотвратяване на развитието на метаболитен синдром [10, 11].

Методи

Подготовка на MLD

отвара

Химични структури и HPLC анализ на основните компоненти в MLD. а дехидротумулозна киселина (C31H48O4, молекулно тегло: 484.71); б глициризинова киселина (C42H62O16, молекулно тегло: 822.93); ° С канелена киселина (C9H8O2, молекулно тегло: 148,16); д HPLC анализ на дехидротумулозна киселина и глициризинова киселина в MLD; д HPLC анализ на канелна киселина в MLD

Животни

Протоколът за изследването е одобрен от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните към Университета по китайска медицина в Гуанджоу и в съответствие с принципите, описани в Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни на NIH. Петдесет възрастни мъжки плъхове Sprague-Dawley (клас SPF) с тегло 200 ± 20 g, на възраст от 6 до 7 седмици, бяха държани в съоръжение за контрол на температурата и влажността на животните и поддържани на 12-часов цикъл светлина/тъмнина с достъп до храна и вода ad libitum. Експериментите бяха проведени по време на светлинната фаза. Всички плъхове имаха свободен достъп до диети и вода в продължение на 1 седмица преди експериментите. Диетата е полупречистена модифицирана формулировка D12451 с енергийни източници, съдържащи 36% енергия и 1% холестерол. Диетичният състав е подобен на нормалния човешки режим.

Лечение на животни

След 1 седмица на аклиматизация, 50 плъха бяха разделени на случаен принцип в пет групи с по десет животни във всяка група. (1) Контролна група (Cont), която приема нормално чау (енергийно съдържание: протеини 23%, въглехидрати 67% и мазнини 10%); (2) диетична група с високо съдържание на мазнини (HFD), която се храни с високомаслена диета (енергийно съдържание: протеини 12%, въглехидрати 18% и мазнини 70%, включително 8% от соево масло и 62% наситени мазнини от свинска мас) за 12 седмици за индуциране на модел на метаболитен синдром. Тази диета с високо съдържание на мазнини, обогатена с наситени мазнини и включена с умерено до ниско съдържание на въглехидрати, преди това е била използвана като обезогенна (причиняваща голямо затлъстяване) и диабетогенна (предизвикваща инсулинова резистентност) храна при плъхове [20]; (3) диета с високо съдържание на мазнини, включена с диетична ограничителна група (HFD-DR), която се храни с 30% от диетата с високо съдържание на мазнини; (4) упражнение, включено с диетична ограничителна група (HFD-DR-Ex), придържано да плува в продължение на 45 минути всеки ден въз основа на HFD-DR; (5) MLD, включена с диетични ограничения и група за упражнения (HFD-DR-Ex-MLD), която дава MLD (съответства на 6.17 g сурово лекарство/kg телесно тегло) чрез перорално приложение всеки ден въз основа на HFD-DR-Ex. Леченията се провеждаха в продължение на 1 седмица след хранене с високо съдържание на мазнини в продължение на 12 седмици.

След едноседмично третиране, всички плъхове се анестезират с интраперитонеална инжекция на хлорални хидри (3,5 mg/kg). След умъртвяването на плъховете, кръвни проби бяха събрани от коремната аорта в епруветки; серумът се отделя чрез центрофугиране при 3500 об/мин за 10 минути и се държи замразен при -80 ° С до химични анализи. Епидидималните и ретроперитонеалните мастни подложки бяха изрязани и претеглени. Черният дроб също се изрязва и претегля, след което се взема лист от черен дроб, фиксиран с неутрален формалдехид за хистологично изследване, останалата част се поддържа при -80 ° C за ELISA.

Обучение за упражнения

Протоколът за тренировъчно упражнение е адаптиран от предварително публикувана процедура [21]. Плуването се извършва в цилиндричен резервоар с диаметър 180 cm и височина 50 cm, температура (29 ± 2) ° C, съгласно протокола. Животните се поставяха в резервоара всеки ден в един и същи час (11: 00-11: 45 ч.) И обучението се наблюдаваше от същия човек. Плъховете плуваха в продължение на една седмица (45 минути/ден), след всяка тренировка животните бяха изсушени и държани в топла среда. Други групови плъхове бяха ограничени до активност в клетката.

Кръвно налягане

Систоличното кръвно налягане се измерва с помощта на система за маншети (Shanghai Alcott Biotech Co., Ltd., Китай) преди и в края на експерименталния период. Всички животни бяха поставени в ограничител за 15 минути, маншет беше прикрепен към опашката им и беше регистрирано кръвното налягане. И за двете мерки плъховете преминаха период на адаптация от 7 дни, за да ги запознаят с процедурата, която започна веднага след периода на адаптация. Валидни стойности на кръвното налягане бяха получени, както е описано на 8-ия ден от измерванията.

Телесно тегло и относително тегло на мастната тъкан и черния дроб

След умъртвяване на плъховете, епидидималните и ретроперитонеалните мастни подложки бяха изрязани и претеглени. Черният дроб също беше почистен и бяха измерени влажните тегла. Теглото се изчислява като процент мокро тегло към телесно тегло.

Биохимични определяния

Глюкозата в серума се анализира от бързия глюкомер. Серум TG, TC, HDL, LDL, свободна мастна киселина (FFA), аспартат аминотрансфераза (AST), глутамино-пировидна трансаминаза (ALT) и алкална фосфатаза (ALP) са анализирани с помощта на комплекти, закупени от Института по биоинженерство в Нанкин Jiancheng (Нанкин, Китай).

Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA)

Серумът се приготвя от периферна кръв. Чернодробните тъкани се отстраняват, хомогенизират се с ледено студен PBS, центрофугират се при 12 000 об/мин за 20 минути и се отделя супернатантата. Нивата на инсулин, лептин, протеин киназа B (PKB) и фактор на туморна некроза-α (TNF-α) в серума и чернодробната тъкан са измерени чрез ELISA в съответствие с инструкциите за производство и изчислени съгласно стандартната крива.

Хистологично изследване

Получава се еднаква чернодробна проба от всеки плъх и се фиксира в 10% неутрален формалин, дехидратира се във възходящ клас алкохол и се изчиства в бензол. Пробите от всяка група се влагат в парафин с точка на топене между 55 и 56 ° С за 4 часа и след това се приготвят парафинови блокове. Парафиновите срезове бяха направени на 5 μm и оцветени с (1) хематоксилин и еозин (HE): за нормална хистология и хистопатология; (2) периодична киселина Schiff (PAS): за откриване на полизахариди като гликоген и лигавици като гликопротеини, гликолипиди и муцини в чернодробните тъкани. Реактивът на Шиф дава лилаво-пурпурен цвят, последван от светлинна микроскопия за демони, демонстриращи всякакви хистологични промени.

Статистически анализ

Всички стойности са изразени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (S.E.M.). Различията между групите бяха определени чрез еднопосочен ANOVA с post hoc тест на Tukey. Статистическите анализи бяха извършени с помощта на SPSS версия 11.0 (SPSS Inc., Чикаго, САЩ). Статистическата значимост беше потвърдена, когато P стойностите са по-малки от 0,05 или 0,01.

Резултати

Телесно тегло и относително тегло на мастната тъкан и черния дроб

Фигура 2 показва телесното тегло и относителното тегло на мастната тъкан и черния дроб след интервенционния период. В сравнение с плъховете Cont, телесното тегло (фиг. 2а) и относителното тегло на мастната тъкан (фиг. 2б) и черния дроб (фиг. 2в) на HFD плъхове е значително увеличено (P Фиг. 2

Нива на TC, TG, LDL, HDL и FFA в серума

Серумните нива на TC, TG, LDL, HDL и FFA са показани на фиг. 3. В сравнение с плъховете Cont, плъховете с HFD доведоха до значително увеличение на TC, TG, LDL и FFA и намаляване на HDL (P Фиг. 3

Нива на AST, ALT и ALP в серума

Серумните нива на AST, ALT и ALP са показани на фиг. 4. В сравнение с плъховете Cont, плъховете с HFD доведоха до значително увеличение на ALT, AST и ALP (P Фиг. 4

Фотомикрография на черен дроб на плъх

Тъй като HE оцветяването на черния дроб на плъхове разкри, Cont плъхове (Фиг. 5а) хистологична архитектура на черния дроб показват нормална лобуларна структура с централна вена, хепатоцити и чернодробни плочи. Черният дроб на HFD плъхове (Фиг. 5b) показва сериозна перипортална фиброза, вакуолизирана цитоплазма и клетъчна инфилтрация. Черният дроб на плъховете HFD-DR (фиг. 5в) показва донякъде нормални чернодробни клетки и ядра, в сравнение с HFD група, вакуолизираната цитоплазма намалява значително. Черният дроб на плъховете HFD-DR-Ex (фиг. 5г) показва някои клетъчни инфилтрации. Черният дроб на плъховете HFD-DR-Ex-MLD (Фиг. 5д) показва малък среден размер на клетките, който е повече или по-малко подобен на нивата на Cont плъховете. Имаше очевидна разлика в разпределението на размера на клетките във всяка група.

Микрофотография на черен дроб на плъхове при плъхове Cont (а), HFD плъхове (б), Плъхове HFD-DR (° С), HFD-DR-Ex плъхове (д) и плъхове HFD-DR-Ex-MLD (д). (HE × 200)

Както PAS оцветяването на черния дроб на плъхове разкри, Cont плъховете (Фиг. 6а) показват нормална архитектура и разпределение на гликоген в чернодробната клетка. Черният дроб на HFD плъхове (фиг. 6Ь) показва промени във всички хепатоцити. Тези клетки станаха големи с вакуолизирана цитоплазма и малки червени оцветени гранули. Черният дроб на HFD-DR плъховете (фиг. 6в) показва по-малко клетъчно уголемяване и по-червено оцветени от HFD плъховете. Черният дроб на плъховете HFD-DR-Ex (фиг. 6г) показва по-малко хепатоцити и малки клетки с червени оцветени гранули, отколкото плъховете HFD-DR. Черният дроб на плъховете HFD-DR-Ex-MLD (фиг. 6д) показва почти нормална чернодробна архитектура.

PAS оцветяване на черен дроб на плъхове при Cont плъхове (а), HFD плъхове (б), Плъхове HFD-DR (° С), HFD-DR-Ex плъхове (д) и плъхове HFD-DR-Ex-MLD (д). (PAS × 200)

АН, кръвна глюкоза и инсулин

Преди експерименталния период няма разлика в АН във всяка група (данните не показват). След интервенционния период, в сравнение с Cont плъховете, HFD плъховете показват значително увеличение на BP (P Фиг. 7

Нивото на TNF-α, лептин и ПКБ в серума и черния дроб

Нивото на TNF-a в серума и черния дроб е показано на фиг. 8а. В сравнение с Cont плъховете, HFD плъховете доведоха до значително увеличение на TNF-α в серума и черния дроб (P Фиг. 8

Дискусия

През последните десетилетия проучванията показват, че HFD насърчава развитието на затлъстяване и че съществува пряка връзка между хранителните мазнини и процеса на затлъстяване. HFD се оказа основният фактор за затлъстяването [22]. Връзката между затлъстяването и МС също е добре демонстрирана в документите, бързо повишеното телесно тегло също се счита за свързано с МС [23-25]. Има и споменати доказателства, че HFD може да причини ненормални нива на лептин, инсулин и ПКБ. В нашия експеримент хранехме HFD, за да предизвика плъхове от модел на затлъстяване. Направените от нас модели на затлъстяване са в съгласие с редица клинични синдроми на МС, включително хипертония, хипергликемия, хиперлипемия, хиперинсулинизъм и повишено съотношение на черния дроб и тъканите към телесното тегло.

Нашите резултати показаха, че диетичните ограничения, включени в аеробни упражнения и MLD, показват ефекти при облекчаване на индуцираното от HFD затлъстяване и дислипидемия. Затлъстяването играе централна роля при МС, както е показано на Фиг. 2, HFD причинява значително увеличение на телесното тегло и мастната тъкан и чернодробната маса в групата с HFD. Те бяха значително намалени от лечението, демонстрирайки ефект срещу затлъстяването от диетични ограничения, включени в аеробни упражнения и MLD. Освен това, в сравнение с този на плъхове с HFD, серумният липиден профил се нормализира чрез лечение, тъй като серумните нива на TC, TG, LDL и FFA са значително намалени и нивата на HDL са значително повишени. Тези констатации са в съгласие с предишната ни работа, показваща хиполипидемични ефекти от диетичните ограничения, включени в лечението на MLD при пациенти [18, 19], което до голяма степен се дължи на повишената фекална екскреция на липиди.

Консумацията на диети, богати на мазнини, може да доведе до натрупване на чернодробна мазнина и чернодробни дисфункции [26], състояния, подчертани от изтичане на клетъчни ензими, като AST, ALT и ALP [27]. В настоящото проучване активността на тези ензими в серума от групата на HFD плъхове е по-висока от тази в контролната група, което показва, че плъховете с група HFD имат тежко увреждане на чернодробните клетки. След интервенция дейностите на AST, ALT и ALP в групата с HFD-DR-Ex-MLD намаляха значително, демонстрирайки затихващ ефект върху чернодробната некроза. Комбинирайки макроскопското наблюдение и хистопатологичното наблюдение на черния дроб, открихме, че в сравнение с контролната група на модела, диетичните ограничения, диетичните ограничения, включени в упражненията за плуване и диетичните ограничения, включени в упражненията за плуване и MLD, могат да намалят отлагането на мазнини и да намалят дегенерацията в чернодробните клетки, черен дроб на плъхове HFD-DR-Ex-MLD показва почти нормална чернодробна архитектура.

Ендотелната дисфункция и повишеното АН играят важна роля за развитието на вторични сърдечно-съдови усложнения при МС [28]. Диетичните ограничения, включени в упражненията и MLD, намаляват значително хипертонията. Резултатите показват, че интервенцията е много ефективна за предотвратяване на систолното повишаване на АН. Доколкото ни е известно, това е първото подробно описание на хипотензивния ефект на MLD при плъхове с HFD. Лечението с диетични ограничения, съчетано с упражнения и MLD, също подобрява параметрите на диабет тип 2. Като такива, нивата на глюкоза са значително намалени от лечението. Освен това лечението може да подобри нивото на инсулин в серума. Инсулинът има значителна връзка с разпределението на телесните мазнини. С увеличаването на адипоза в клетъчната популация чувствителността на популацията постепенно намалява, което е ненормален механизъм за обратна връзка на клетъчната ос, за да се получи хиперинсулинемия, но хиперинсулинемията може допълнително да влоши метаболитното нарушение на липидите в кръвта. В нашия експеримент съдържанието на инсулин в серума на плъховете от групата на HFD значително се увеличи. След интервенция съдържанието на серумен инсулин в групите с HFD-DR-Ex и HFD-DR-Ex-MLD намалява значително.

Заключения

В обобщение, MLD, включен с диетични ограничения и физическо натоварване, показват ефекти при облекчаване на затлъстяването, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини, хипергликемия, хиперлипидемия, хипертония, чернодробно увреждане и инсулинова резистентност, които вероятно се дължат на регулирането на TNF-α, лептин и PKB; и това лечение може да се използва като нов терапевтичен график на МС с високо съдържание на мазнини.