Резюме

Доказано е, че KD с високо съдържание на мазнини и ниско съдържание на въглехидрати е ефективен при неразрешими детски епилепсии (1). Метаболитните ефекти на KD са сравними с продължителното гладуване. Глюкозните субстрати се заменят с β-OHB, ацетоацетат и свободни мастни киселини. Карнитинът играе основна роля в разграждането на мастните киселини. Като триметилирана аминокиселина, тя улеснява транслокацията на мастни киселини в митохондрията и следователно е съществен кофактор при окисляването на мастните киселини и кетогенезата (2). При бозайници са показани промени в модела на карнитин в плазмата и няколко тъкани с промени в хранителното състояние. Проучванията при хора показват забавено намаляване на плазмения карнитин и бързо увеличаване на дългите и особено късоверижните ацилкарнитини по време на гладуване или диабетна кетоза (3-5). Изследване при деца демонстрира, че промените в ацилкарнитини по време на натоварване с мазнини (поглъщане на слънчогледово масло) са повече или по-малко сравними с тези по време на гладуване (6). Досега обаче не са докладвани проучвания върху динамиката на метаболизма на карнитин, по-специално C4OH, по време на започване на KD.

Техниката на MD е мощен инструмент за изследване на метаболизма на тъканите. Методът се основава на дифузията на вещества през полупропусклива диализна мембрана, имплантирана в интересуващата тъкан. Тя позволява многократно измерване на концентрациите на тъканни молекули, преминали през мембраната. Водоразтворимите аналити с молекулно тегло под изключващия размер на катетъра преминават през мембраната, докато техните концентрации в извънклетъчната течност и микродиализата се изравнят (7,8). В клиничната практика е установена MD, особено в невроинтензивните грижи за наблюдение на глюкоза, лактат, пируват, глицерол и урея в леглото (9,10).

Карнитините, измерени в течността на MD, отразяват несвързаните метаболити на карнитина в околната тъкан. C0 и късоверижните ацилкарнитини като C2 и C4OH се срещат предимно в свободната им форма. Ацилкарнитини в плазмата и интерстициума са частично свързани с плазмените протеини. Скоростта на свързване на протеините карнитини се увеличава с дължината на свързаната мастна киселина.

Досега MD не се използва за измерване на карнитин в човешки тъкани. В нашето проучване ние показваме, че MD може да се използва за определяне на метаболитите на карнитина в s.c. тъкан. Освен това, тази техника позволява подробен анализ на промените в s.c. модел на карнитин с KD с течение на времето.

ПАЦИЕНТИ И МЕТОДИ

Използваното MD устройство (CMA/Microdialysis AB, Solna, Швеция) е CE сертифицирано за клинично приложение върху човешкия мозък и s.c. тъкан. Изследването е одобрено от местната комисия по етика и е получено писмено съгласие от родителите.

Пациенти.

Седем педиатрични пациенти са започнали лечение на KD за нелечима детска епилепсия. Средната възраст на пациента е 2,5 години (диапазон 0,9–10,6 години).

KD се състои от дълговерижни триглицериди със скорост 4: 1 (4 g мазнини/1 g протеин + въглехидрати) и е въведен с начален период на гладуване съгласно стандартен протокол (11,12).

Гладуването започва в 1900 h от деня на поставяне на MD катетър (d 0) и продължава 24 h (d 1). На 1900 h от d1 пациентите получават първото кетогенно хранене, състоящо се от една трета от крайната им калорична нужда. На d 2 количеството калории беше увеличено до две трети и разделено на четири хранения. От d 3 нататък пациентите получават пълното количество калории в четири кетогенни хранения на ден.

Тъй като рискът от метаболитна декомпенсация е особено висок по време на започване на KD, ние внимателно наблюдавахме пациентите, определяйки глюкоза, лактат и пируват чрез s.c. Д-р. Освен това, всяка сутрин на празен стомах и след това на всеки 4 часа β-OHB, глюкоза и газове се получават чрез капилярни кръвни тестове.

Микродиализа.

Принципите на MD са описани подробно по-рано (13–15). Използвахме катетър CMA 70 MD (CMA/Microdialysis AB) с дължина на диализната мембрана 20 mm. Размерът на молекулното изключване на полиамидната мембрана е 20 kD. Според приложението при новородени и деца (16,17), MD катетрите са поставени при стерилни условия при трансдермална локална анестезия (EMLA, Wedel, Германия) в s.c. тъкан на страничното бедро (по-малки деца) или предмишницата (по-големи деца). Интравенозни пластмасови канюли (Vasofix Braunüle, 18 G; Braun Melsungen, Melsungen, Германия) бяха използвани като водачи.

Катетърът непрекъснато се перфузира със стерилен разтвор на изотон (NaCl 0,9% Braun Melsungen). Ниският дебит от 0,3 μL/min се осигурява от задвижвана от батерии помпа (CMA 106 MD помпа, CMA/Microdialysis AB). Диализатните проби бяха събрани в микровиали (CMA/Microdialysis AB) в държач за флакон, фиксиран в края на изходната тръба на катетъра. Продължителността на MD варира от 4 до 7 дни и се извършва без никакви усложнения. Диализатите се събират на всеки 2 часа и първо се анализират за глюкоза, лактат и пируват до леглото в анализатора за микродиализа CMA 600 (CMA/Microdialysis AB). Остатъчните диализати бяха замразени при -21 ° C за последващо определяне на карнитин.

Определяне in vitro на относителната степен на възстановяване на карнитини.

Концентрациите на интересуващите вещества в диализата са пропорционални на концентрациите в извънклетъчната течност, в зависимост от дължината и текстурата на мембраната, скоростта на потока и температурата на тъканите, изразени в относителната скорост на възстановяване (RR) на MD системата: RR = концентрация ( диализат)/концентрация (околна среда).

Определено е относителното възстановяване в нашата система инвитро чрез потапяне на катетъра в тестови разтвори от разреден или допълнен с карнитин човешки серум.

Чрез добавяне на 0,9% разтвор на NaCl или карнитин към човешки серум се получават разтвори с шест различни концентрации. Те съдържат C0 в диапазона от 5 до 174 μmol/L, C2 в диапазона от 7 до 65 μmol/L и C4OH в диапазона от 0,09 до 0,43 μmol/L.

За да се избегнат матричните ефекти на серумните протеини и да се създадат условия на тъканна течност, стандартните разтвори се приготвят чрез ултрацентрифугиране, като се използват ултрацентрифужни епруветки (Centrisart®, Sartorius AG Göttingen, Германия) с размер на молекулно изключване 20 000 D.

След това CMA 70 MD катетър с дължина на мембраната 20 mm се потапя в ултрафилтратите и се разбърква при стайна температура. MD беше извършен в in vivo скорост на потока от 0,3 μL/min и се уравновесява в продължение на най-малко 4 часа преди събирането на диализат. Количествено се определят С0 и ацилкарнитини в ултрафилтрати и диализати и съотношението на концентрациите на карнитин в ултрафилтратите и диализатите се използва за определяне на RR на MD системата.

Определяне на карнитина.

C0 и ацилкарнитини се определят количествено в тандемен мас спектрометър Perkin Elmer API 365 (18). Карнитините в микродиализатите и ултрафилтратите се определят директно чрез масспектрометрия.

Статистически анализ.

Статистическият анализ беше извършен с помощта на компютърната програма Statistics Package for Social Science версия 11.5 (SPSS Inc, Чикаго, Илинойс). Статистическата значимост беше тествана чрез дисперсионен анализ за повторни измервания. Post hoc тестовете бяха извършени едностранно. Използвайки корекция на Bonferroni, нивото на значимост беше определено на 1,7%. Резултатите се изразяват като медиана (диапазон) или средна стойност (± SD).

РЕЗУЛТАТИ

RR in vitro.

RR инвитро беше определен за CMA 70 MD катетър при скорост на потока 0,3 μL/min. Съотношението на концентрациите на карнитин в диализата и в ултрафилтрата разкрива средно RR от 86% (± 7%) за C0, от 88% (± 7%) за C2 и от 83% (± 9%) за C4OH ( Маса 1).

Промени в модела на карнитин на тъканите.

По време на началния период на гладно (24 часа) нивата на β-OHB се повишават в периферната кръв от 0,13 mmol/L (± 0,14 mmol/L) до 2,80 mmol/L (± 1,91 mmol/L). След 2 d на KD (d 3), нивата на β-OHB надвишават 5 mmol/L при всички пациенти.

Подкожните нива на С2 са се увеличили значително (стр = 0,001) през периода на гладуване, от 5,13 μmol/L (2,39–6,49 μmol/L) преди гладуване до 13,13 μmol/L (5,35–21,1 μmol/L) след 24 часа гладуване. C2 се увеличава непрекъснато с KD до концентрация от 22,42 μmol/L (9,13–27,24 μmol/L) след 24 часа кетогенно хранене и след това остава стабилен (Фиг. 1A).

кетогенна

Влияние на кетозата върху С2 (A), C4OH (Б.) и C0 (° С) в s.c. тъкан. C2 (μmol/L) и C4OH (μmol/L) се увеличават значително при гладуване и кетогенно хранене (pC2 = 2 × 10 −7, pC4OH = 1.4 × 10 −5). s.c. C0 (μmol/L) намалява бавно с кетоза (стр = 0,001). Всяка кутия е базирана на 28 стойности (четири стойности на пациент).

Подкожните нива на C4OH са се увеличили 3,6 пъти за 24 часа на гладно от 0,01 μmol/L (0,01–0,02 μmol/L) до 0,05 μmol/L (0,04–0,22 μmol/L) (стр = 0,0025). C4OH достига 0,33 μmol/L (0,12–0,41 μmol/L) след 24 часа KD. Нивото е 23 пъти по-високо от нормалното хранене и остава стабилно през втория ден на KD (Фиг. 1Б.).

C0 в s.c. тъканта намалява бавно от 33,68 µmol/L (22,48–54,47 µmol/L) до 28,24 µmol/L (20,89–33,94 µmol/L) след гладуване (незначително) и достига 23,62 µmol/L (19,31–28,83 µmol/L) след 2 d от KD (значително до първоначалната стойност при нормално хранене, стр = 0,0045) (Фиг. 1° С).

Открихме силна положителна корелация на нивата на β-OHB в кръвта и C4OH в s.c. тъкан (r = 0.91, фиг. 2) и умерена корелация на β-OHB в кръвта и C2 в s.c. тъкан (r = 0,7).

Серумният β-OHB корелира силно със s.c. C4OH. β-OHB е начертан срещу C4OH в диализата (r = 0,91, включително данни за седем пациенти).

В съответствие с промените в карнитина в s.c. тъкан, забелязахме намаляване на серумния C0, както и повишаване на C2 и C4OH с нарастваща кетоза.

ДИСКУСИЯ

Използвахме s.c. MD при деца за проследяване на KD чрез промени в модела на карнитин в тъканите на C0, C2 и C4OH.

Високото относително възстановяване на MD системата инвитро направени с.к. MD, подходящ за проследяване на концентрациите на карнитин в тъканите (15).

Кетозата при деца се предизвиква на гладно и се поддържа с кетогенно хранене, придружено от характерни промени в метаболитите на карнитина в s.c. тъкан. По този начин C0 бавно намалява, докато C2 и C4OH бързо се увеличават с кетоза.

Досега експериментите на гладно при животни и хора разкриха промени в модела на карнитин в кръвта и урината, подобни на нашите открития. При гладуване или диабетна кетоза е установено забавено намаляване на плазмената и урината на С0 и бързо нарастване на дългите и особено късоверижните ацилкарнитини, които корелират добре с нарастващите плазмени нива на кетони (4,5,19). Няколко животински тъкани също са проучени за метаболити на карнитин при кетотични условия, като черен дроб (20–23), скелетни мускули (20–23), сърце (22–24), бъбреци (20,23) и мозък (24).

Нивата на С0 намаляват главно поради това, че се съхраняват в естерифицирана форма. Изследвания на Hoppel и Genuth (19) разкриват увеличаване на отделянето на ацилкарнитини с урината по време на кетоза, което може да доведе до загуба на карнитин.

Увеличението на C2 отразява увеличаване на ацетил-коензим А (CoA), крайният продукт на β-окислението. Чрез карнитин ацетилтрансфераза в митохондриите ацетиловата група се прехвърля в карнитин в зависимост от равновесната константа на ензима. Чрез генериране на C2 от ацетил-CoA, карнитинът може да действа като ацилна мивка, за да поддържа адекватни клетъчни нива на свободен CoA (25). Според Hoppel и Genuth (19) съотношението C2/карнитин отразява съответното съотношение CoA и така може да отразява енергийното ниво.

Промени в модела на C4OH, особено в комбинация с карнитини, не са проучени досега. Нашето проучване на MD разкри характерните промени в s.c. C4OH модел, който корелира с нарастващите нива на β-OHB в кръвта. След 24 часа гладуване нивата са се увеличили петкратно и допълнително са се увеличили с KD до стойност 23 пъти по-голяма в сравнение с нивото преди гладуването. S.c.c. C4OH е силно корелиран с нивото на кетонните тела в кръвта (r = 0.91). В зависимост от концентрацията си, β-OHB може да бъде свързан с карнитин в неспецифична ензимна реакция, както е описано за ацетоацетил-КоА (25). Така че C4OH/CO може също да бъде индиректен маркер на енергийното ниво. Освен това C4OH може да бъде много чувствителен параметър за степента на кетотичното състояние, тъй като включва параметър на карнитиновия резерв на организма като предпоставка за ефективния метаболизъм на кетонните тела. Показвайки достатъчно ниво на заместен карнитин, C4OH може да бъде по-точният параметър за наблюдение на състоянието на кетоза, отколкото само кетонните тела.

Заключваме, че KD е терапевтично хранене, което причинява важни промени в метаболизма на пациентите и е от полза внимателното проследяване на енергийното състояние на пациентите, особено по време на започване на диетата. Подкожната МД в комбинация с спектрометрично определяне на карнитин позволява минимално инвазивно, близко и широко наблюдение на тъканния метаболизъм.