Подобни теми на научна статия по биологични науки, автор на научна статия - Ели Зайова, Ира Станчева, Мария Женева, Мария Петрова, Румяна Василевска-Иванова

Академична изследователска работа на тема "Морфологична оценка и антиоксидантна активност на растения Echinacea purpurea in vitro и in vivo"

Централноевропейски вестник по биология

морфологична

Морфологична оценка и антиоксидантна активност на in vitro и in vivo ехинацея

Ели Зайова, Ира Станчева *, Мария Женева, Мария Петрова, Румяна Василевска-Иванова

Институт по растителна физиология и генетика, БАН, 1113 София, България

Получено на 18 ноември 2011 г .; Приет на 23 април 2012 г.

Резюме: Описан е ефективен in vitro протокол за бързо клоново размножаване на Echinacea purpurea (L.) Moench чрез тъканна култура.

Процедурата за размножаване in vitro се състои от четири етапа: 1) начален етап - получаване на разсад върху базална среда Murashige и Skoog (MS) с 0,1 mg L-1 6-бензиламинопурин, 0,1 mg L-1 а-нафтален оцетна киселина и 0,2 mg L-1 гиберелова киселина;

2) етап на размножаване - образуване на издънки на MS среда, допълнено само с 1 mg L-1 6-бензиламинопурин, води до 9,8 издънки на експлант и в комбинация с 0,1 mg L-1 a-нафталин оцетна киселина води до 16,2 издънки на експлант;

3) етап на вкореняване - вкореняване на издънки на полусилна MS среда с 0,1 mg L-1 индол-3-маслена киселина, което води до 90% вкоренени микрорастения;

4) ex vitro аклиматизация на растенията. Сместа от торф и перлит е най-подходящият субстрат за засаждане за втвърдяване и осигурява висока честота на оцеляване на размножените растения. Наблюдавани са значително по-високи нива по отношение на водоразтворимите и разтворимите в липиди антиоксидантни способности (изразени като еквиваленти на аскорбат и а-токоферол) и общото съдържание на пненоли в екстракти от цветя на ехинацеи, получени от инвитро размножени растения и адаптирани към полевите условия в сравнение с традиционно култивирани растения.

MS - среда Murashige и Skoog;

PGR - регулатор на растежа на растенията;

GA3 - гиберелова киселина;

АА - аскорбинова киселина;

IBA - индол-3-маслена киселина;

NAA - а-нафтален оцетна киселина.

Echinacea purpurea L. Moench (Asteraceae) или пурпурен конус е широко разпространено лечебно растение, използвано в разнообразна гама от билкови продукти. Доказано е, че ехинацеята е един от най-обещаващите имуностимулатори и модулатори, с множество научни изследвания и богати клинични доказателства в негова полза [1-3]. Нарастващото търсене на E. purpurea се нуждае от разработване на бързи методи

размножаване на растенията и по-бързо въвеждане на нови сортове с желани черти [4]. Растенията от E. purpurea обаче произвеждат силно хетерозиготно потомство в полето [5]. В това отношение in vitro културите на тъканите се оказват ценна техника за получаване на генетично хомогенен растителен материал. Идентифицирани са 58 уникални линии на зародишна плазма, базирани на скрининг за антиоксидантна активност и концентрации на кафетанова киселина, хлорогенова киселина, цихорова киселина, цинарин и ехинакозид от размножени от клони растения, получени от разсад [6].

Няколко in vitro техники са разработени в E. purpurea [3,4,7-9], тъй като някои от генотипите показват висок коефициент на in vitro разпространение [8,10,11]. Прилагането на биотехнологични техники може да предложи възможност за производство на голямо количество еднородни висококачествени растения за кратък период от време и ограничено пространство за получаване на биомаса като източник на биологично активни съединения [3]. Въпреки това много въпроси относно неговата in vivo и in vitro култура остават все още нерешени. В България E. purpurea се отглежда на ограничена площ и информацията

за отглеждането му е лошо. Използването на сортове ехинацея с по-добри характеристики на културите и по-голяма адаптация към климатичните условия са от съществено значение за получаване на висококачествена суровина. Активните съставки, използвани във фармацевтичната промишленост, обикновено се извличат от надземни растителни части. По отношение на тези биологично активни вещества, листата и съцветията на растенията са много важни за анализ [12].

Много лечебни растения съдържат големи количества антиоксиданти, различни от витамин С, витамин Е и каротеноиди [13]. Нараства интересът към естествените антиоксиданти, напр. полифеноли, фенилпропаноиди, флавоноиди и фенолни киселини, присъстващи в лечебни и диетични растения, които могат да помогнат за предотвратяване на окислителните щети. Антиоксидантната активност на фенолите се дължи главно на техните редокс свойства, които им позволяват да действат като редуциращи агенти или донори на водородни атоми. По този начин естествените антиоксиданти функционират като чистачи на свободни радикали и прекъсвачи на вериги, комплексари на прооксидантни метални йони и гасители на образуването на синглетно-кислород [14]. Антиоксидантната активност на E. purpurea е резултат от фенолната киселина, особено от съдържанието на кофеин и р-кумарова киселина. Големият брой полезни съединения в лечебни и ароматни растителни видове е предпоставка за екобиологични изследвания, насочени към култивиране на природни антиоксиданти и търсене на нови области за приложение.

Целта на настоящото проучване беше да се оцени и сравни морфологичният статус и антиоксидантната активност на растения E. purpurea, произведени както по конвенционален, така и по биотехнологичен подход.

2. Експериментални процедури

2.1 Протокол за размножаване на E. purpurea при in vitro условия

Протоколът за in vitro размножаване на E. purpurea, етапи и хранителна среда и културни условия е представен накратко в Таблица 1.

2.1.1 Растителни материали, стерилизация и покълване на семена

Семена от E. purpurea бяха закупени от Suttons Consumer Products Ltd., Woodview Road, Paignton, Devon TQ4 7NG, Англия, и бяха стратифицирани при 4 ° C в продължение на две седмици. Стерилизацията на повърхността се извършва със 70% (w/v) етанол за 2 минути и чрез потапяне в 15% (w/v) търговски разтвор за избелване за 10 min. Стерилизираните семена се изплакват три пъти в стерилна дестилирана вода за отстраняване на белина. Семената са покълнали на две основни среди Murashige и Skoog [15], допълнени със захароза (30 g L-1), 6-бензиламинопурин BAP (0,1 mg L1), NAA (0,1 mg L-1) и GA3 (0,2 или 0,4 mg L-1). След 14 дни всички разсад бяха субкултивирани на базална среда MS в присъствието на BAP (0,5 mg L-1), GA3 (0,4 mg L-1) и аскорбинова киселина (1,0 mg L-1) два пъти през 21 дни за превръщане на разсад в стабилни растения.

2.1.2 Микроразмножаване на издънките и вкореняване на растенията

За пролиферация, растеж и развитие на издънките е проведен експеримент с използване на цитокинин BAP (0,5 или 1,0 mg L-1) самостоятелно или в комбинация с ауксин NAA (0,1 mg L-1) в среда MS. Тези добавки бяха избрани сред много от тестваните регулатори на растежа на растенията, тъй като те бяха най-подходящи за формиране на издънки [16]. Честотата на формиране на издънките и броят на развитите издънки се определят след четири седмици на инкубация. Подкултивирането се извършва на интервали от четири седмици.

За индуциране на корени, издънките се култивират върху пет основни среди с половин якост MS; една MSR0 среда за вкореняване без ауксин (контрол) и друга среда за вкореняване на MSR, допълнена с NAA или IBA при концентрации от 0,1 или 0,5 mg L-1. Данните са записани след три седмици култивиране и е установен процент на вкоренени растения и среден брой корени/издънки.

РН на всички среди се регулира до 5.8 и се втвърдява с 0.7% (w/v) агар преди автоклавиране при налягане от 1.1 kg cm-2 за 20 минути. Разсадът и

Етапи Средни условия на култура

Кълняемост на семена MSG1 + 0,1 mg L-1 BAP + 0,1 mg L-1 NAA + 0,2 mg L1 GA3 14 дни при 22 ± 2 ° C, 16 h фотопериод, 40 pmol m-2 s-1 интензивност на светлината

Микроразмножаване на издънки MSP2 + 1 mg L-1 BAP MSP4 +1 mg L-1 BAP + 0,1 mg L-1 NAA 28 дни при 22 ± 2 ° C, 16 h фотопериод, 40 pmol m-2 s-1 интензитет на светлината

Вкореняване на растения MSR3 + 0,1 mg L-1 IBA 21 дни при 22 ± 2 ° C, 16 h фотопериод, 40 pmol m-2 s-1 интензивност на светлината

Ex vitro аклиматизация на растенията Торф: Перлит (2: 1 v/v) 21 дни при 25 ± 1 ° C, 16 h фотопериод, 50 pmol m-2 s-1 интензитет на светлината

Таблица 1. Протокол за размножаване на E. purpurea при in vitro условия.

MSG - покълваща среда; MSP - среда за разпространение; MSR - среда за вкореняване

културите на издънките се поддържат при температура 22 ± 2 ° C под 16/8 h (светло/тъмно) фотопериод под 40 | jmol m-2 s-1 интензивност на светлината в камерата за растеж, осигурена от бели хладни флуоресцентни лампи.

2.1.3 Аклиматизация на растенията при условия ex vitro

Вкоренените растения бяха извадени от епруветките за култивиране и прехвърлени в пластмасови саксии (диаметър 8 cm), съдържащи три вида смес: 1) Торф и перлит (2: 1v/v); 2) Торф, почва и перлит (2: 1: 1 v/v) и 3) Торф, кокосови влакна и перлит (2: 1: 1 v/v). Растенията се държат в камера за растеж, настроена на 25 ± 1 ° С под 50 pmol m-2 s-1 интензивност на светлината и 16/8 h фотопериод за аклиматизация. Саксийните растения бяха покрити с прозрачна полиетиленова мембрана, за да се осигури висока влажност. Степента на преживяемост е регистрирана три седмици след аклиматизацията при условия ex vitro и растенията са въведени в оранжерията за още две седмици. След това получените растения бяха трансплантирани на полето.

2.2 Конвенционално размножаване на растения от E. purpurea

са били използвани за записване на височината на растението (cm), броя на фрезите на растение, броя на цветята на растение, броя на цветята на основната фреза, броя на цветята на растение и диаметъра на цветята (cm). За да се анализират антиоксидантните активности, пробите от лукови цветя бяха събрани от интензивно цъфтящи растения в полето.

2.3 Антиоксидантна способност

Спектрофотометрично количествено определяне на водоразтворимия и липидоразтворимия антиоксидантен капацитет, изразено като еквиваленти на аскорбат и а-токоферол, беше извършено чрез образуването на фосфомолибден комплекс

[17]. Анализът се основава на редукция на Mo (VI) до Mo (V) чрез анализ на пробата и последващо образуване на зелен фосфат/Mo (V) при кисело рН. 0,5 g растителен сух материал се смила с пестик и хоросан до фин прах. Добавят се 3 ml dH20 и суспензията се хомогенизира, прехвърля се в епруветки и се разклаща в продължение на 1 h при стайна температура на тъмно. Суспензията се филтрира и екстракцията се повтаря с 3 ml dH2O. Пулпът отново се промива с 2 ml dH20. За липидно разтворим антиоксидантен капацитет (изразен като a-токоферол) процедурата е същата, освен екстракцията се извършва с хексан като разтворител.

Методът е оптимизиран и характеризиран по отношение на линейния интервал, повтаряемостта и възпроизводимостта и моларните коефициенти на абсорбция за количествено определяне на водоразтворимите и разтворимите в липиди антиоксидантни способности, изразени като еквиваленти на аскорбат и a-токоферол [17]. Коефициентите на абсорбция са: (3,4 ± 0,1) x103 M-1 cm-1 за аскорбинова киселина и (4,0 ± 0,1) x103 M-1 cm-1 за a-токоферол.

Общият антиоксидантен капацитет (активност на почистване на свободните радикали) е измерен от избелването на лилаво оцветен метанолов разтвор на инхибиране на свободните стабилни радикали (дифенилпикрил-хидразил, DPPH ^) след Tepe et al.

[18]. DPPH радикалът е стабилен радикал с максимална абсорбция при 517 nm, който лесно може да претърпи редукция от антиоксидант. Инхибирането на свободните радикали DPPH в проценти (I%) се изчислява по следния начин:

където А. „е абсорбцията на контролната реакция

(съдържащ всички реагенти с изключение на изпитваното съединение), Asample е абсорбцията на изпитваното съединение, т.е.

За определяне на пробите от сухи листа на фенолите и флавоноидите, 1 g се смила и екстрахира изчерпателно с 96% (v/v) метанол. Съдържанието на фенолни съединения се определя спектрофотометрично, като се използва реагент Folin-Ciocalteu и се изчислява като еквиваленти на кофеинова киселина [19]. Флавоноидите в растителните тъкани са измерени от Zhishen et al. [20] спектрофотометрично, използвайки стандартна крива на катехин.

2.4 Статистически анализ

За всяко третиране бяха отгледани двадесет растения и всички експерименти бяха повторени два пъти. Данните бяха подложени на еднопосочен ANOVA дисперсионен анализ за сравнение на средните стойности и значителни разлики бяха изчислени според теста на Fisher LSD на ниво 5%, използвайки статистически софтуерен пакет (Statigraphics Plus, версия 5.1 за Windows). Данните се отчитат като средни стойности ± стандартна грешка.

3.1 Микроразмножаване на E. purpurea

Разработеният протокол за микроразмножаване на E. purpurea, който включва четири етапа, беше представен в таблица 1, както следва: 1) Установяване на асептична култура, 2) Размножаване, 3) Ризогенеза и 4) Аклиматизация. Първият етап разкрива, че повърхностната стерилизация е била успешна при осигуряването на покълване на семена без замърсяване. Резултатите показаха, че кълняемостта на семена върху базална среда MSG1 и MSG2 води до средна степен на покълване съответно от 70% и 65% (Таблица 2, Фигура 1а). Очевидно беше, че подходяща комбинация от BAP (0.2 mg L1), GA3 (0.2 mg L-1) и аскорбинова киселина (1.0 mg L-1) може да се използва за подобряване на растежа на ехинацея, особено когато разсадът се трансформира в стабилни растения. През този период се наблюдава само удължаване без размножаване на издънки. Ниската концентрация на BAP в комбинация с GA3 и AA положително повлиява растежа и развитието на издънките.

По време на етапа на размножаване, MS среда, допълнена с BAP (0,5 или 1,0 mg L-1) самостоятелно или в комбинация с ниско ниво на NAA (0,1 mg L-1), насърчава образуването на издънки. Получена е висока честота на размножаване и по-голям брой многократни издънки както на среда MSP2, така и на среда MSP4 (Таблица 2). Установено е, че BAP в концентрация от 1,0 mg L-1 е подходящ за индукция на издънки (Фигура 1 b). Също така, взаимодействието на BAP (1,0 mg L-1) и ниското ниво на NAA (0,1 mg L-1) има значителен ефект върху производството на броя на издънките. Процентът на размножаване на издънките, както и броят на издънките на експлант остават високи по време на много пасажи.

Ефектът на различни видове ауксини при различна концентрация върху ризогенезата на E. purpurea е описан от нас по-рано [16]. В това проучване добавянето на ауксини IBA или NAA при две концентрации в среда с полусилна MS води до индукция на адвентивни корени (Таблица 2). Образуване на корени от основния край на издънките се наблюдава десет дни след прехвърляне в среда за вкореняване. Присъствието на ауксините (IBA или NAA) в средата с полусилна MS е установено, че е по-ефективно от контролната среда за вкореняване на растения от ехинацея. По този начин, IBA (0,1 mg L-1) насърчава голям брой корени, докато NAA при същата концентрация дава дълги корени (Фигура 1в и 1 d). Честотата на вкореняване достига максимум след три седмици култивиране.

Периодът на аклиматизация на растенията in vitro към условия ex vitro е решаваща стъпка за развитието на нови автотрофни структури, способни да се справят с нормалната среда. В този смисъл субстратът за саксиране е

№ Регулатори на растежа на растенията, mg L-1 BAP GA3 NAA IBA Кълняемост на семена,% Образуване на издънки,% Брой издънки Експлантат-1 x ± SE Вкоренени растения,% Корен брой Растение-1 x ± SE

MSG1 0,1 0,2 0,1 70

MSG2 0,1 0,4 0,1 65

MSP1 0,5 50 3,3 ± 0,2

MSP2 1 85 9,8 ± 0,5

MSP3 0,5 0,1 75 5,7 ± 0,3

MSP4 1 0,1 90 16,2 ± 0,8

MSR0 0 0 35 0,9 ± 0,1

MSR1 0,1 75 2,1 ± 0,2

MSR2 0,5 40 1,5 ± 0,3

MSR3 0,1 100 5,5 ± 0,2

MSR4 0,5 80 3,6 ± 0,4

Таблица 2. Ефективност на микро размножаването на E. purpurea.

MSG - покълваща среда; MSP - среда за разпространение; MSR - среда за вкореняване

Фигура 1. Микроразмножаване на E. purpurea: а) покълване на семена in vitro; б) размножаване на изстрел на MS + 1,0 mg L-1 BAP; в) вкоренено растение на MS + 0,1 mg L-1 IBA; г) вкоренено растение на MS + 0,1 mg L-1 NAA; д) ex vitro аклиматизация; е) растения в полето (първа година) и ж) растения в полето (втора година).

важен фактор за аклиматизацията. В нашия случай трите тествани смеси имаха благоприятни ефекти върху оцеляването на растенията и растежа на растенията, но се установи, че торфът и перлитът са най-подходящата смес за втвърдяване, което осигурява по-висока степен на оцеляване (95%) на размножените растения (Фигура 1д). Успешно адаптираните растения бяха прехвърлени в оранжерия, където продължават да растат и да се развиват. Накрая те бяха засадени на полето. Степента на оцеляване на in vitro растенията на полето след аклиматизация в оранжерията е 90%. Те са били морфологично идентични по височината на растенията и цвета на съцветията през втората година от развитието (Фигура 1g).

3.2 Конвенционално размножаване на E. purpurea

Резултатите показаха, че сухата студена стратификация на семената силно стимулира кълняемостта. Наблюдават се значителни разлики в степента на покълване между стратифицирани и не стратифицирани семена, култивирани на един и същ хранителен субстрат. По този начин процентът на кълняемост на семената без стратификация е 65%, докато този на стратифицираните семена е по-висок и достига 90%. Беше заключено, че процесът на стратификация увеличава кълняемостта на семената. Видимо покълване на семената се наблюдава след 12-14 дни (Фигура 2а). Разсадът след убождане в малки саксии се развива нормално (Фигура 2b) и в рамките на 10 седмици растенията са готови да бъдат

трансплантирани в полето. Растенията цъфтяха през втората година (Фигура 2в, г).

Морфологични признаци Растения от in vitro култура x ± SE G1 Растения от in vivo разсад G2 G3 Средно x ± SE

Височина на растението, см 65,4 ± 0,8а 54,8 75,2 107,6 79,2 ± 3,2б

Брой фрези на растение 16.0 ± 0.5b 12 6 7 8.3 ± 0.5a

Площ на листата на основната румпел, cm2 50.0 ± 1.8a 50 66 78 64.7 ± 3.1b

Брой на цветята на основната румпел 6.0 ± 0.5b 4 3 5 4.0 ± 0.4a

Брой цветя на растение 20.0 ± 0.6b 15 18 14 15.7 ± 0.4a

Диаметър на съцветието, см 7,5 ± 0,2а 6,5 8 9 7,8 ± 0,2а

Таблица 3. Морфологична характеристика на растения E. purpurea, получени от in vitro култура и от in vivo разсад, отглеждан в полето.

За всяко третиране бяха избрани двадесет растения. Данните се отчитат като средни стойности ± стандартна грешка. Различните букви показват значителни разлики, оценени чрез LSD тест на Fisher (P