Катедра по травма, ръце и реконструктивна хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

дози

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Катедра по травма, ръце и реконструктивна хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия. T: + 49‐6841‐16‐31502; F: + 49‐6841‐16‐31503 Потърсете още статии от този автор

Катедра по травма, ръце и реконструктивна хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Институт за клинична и експериментална хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Институт за клинична и експериментална хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

Катедра по травма, ръце и реконструктивна хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Катедра по травма, ръце и реконструктивна хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Катедра по травма, ръце и реконструктивна хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Институт за клинична и експериментална хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

Катедра по травма, ръце и реконструктивна хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Катедра по травма, ръце и реконструктивна хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия. T: + 49‐6841‐16‐31502; F: + 49‐6841‐16‐31503 Потърсете още статии от този автор

Катедра по травма, ръце и реконструктивна хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Институт за клинична и експериментална хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Институт за клинична и експериментална хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

Катедра по травма, ръце и реконструктивна хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Катедра по травма, ръце и реконструктивна хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Катедра по травма, ръце и реконструктивна хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Център за съвместни изследвания, Фондация AO, Хомбург/Саар, Германия

Институт за клинична и експериментална хирургия, Университет на Саар, Хомбург/Саар, Германия

P. Garcia и V. Speidel допринесоха еднакво за тази работа.

Резюме

Извън ролята си в регулацията на пролиферацията на червените кръвни клетки, е доказано, че гликопротеиновият еритропоетин (ЕРО) упражнява защитни и регенеративни действия в различни нехемопоетични тъкани. 1

В предишно проучване бихме могли да покажем, че ежедневното прилагане на 5000 U/kg EPO в продължение на 5 дни (висока доза, краткотрайно) подобрява ранната ендохондрална осификация и механичната якост при модел на затворена бедрена фрактура при мишки. 2 Първоначалният ефект от прилагането на EPO за кратко и високо дозиране беше изчезнал след 5 седмици, най-вероятно поради добрия заздравителен отговор на затворени фрактури при мишки и ограничението на приложението на EPO само до 5 дни след фрактурата. В настоящото изследване анализирахме дали EPO е способен да ускори зарастването на фрактури с малки сегментни дефекти при мишки. Тъй като няколко проучвания показват, че високи дози ЕРО до 5000 U/kg/ден не са необходими за постигане на защита на тъканите и че тези високи дози могат да бъдат свързани с неблагоприятни ефекти, 3 ние проучихме лечение с ниски дози само с 500 U/кг/ден EPO. Освен това, тъй като е доказано, че ЕРО-рецепторът се експресира в периосталния калус в продължение на няколко седмици по време на зарастването на фрактурата, 2 ЕРО е дадено в настоящото проучване като дългосрочно лечение за период от 5 седмици.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Животни

В настоящото проучване бяха използвани общо 52 CD-1 мишки (телесно тегло 35 ± 3 g). Мишките бяха държани с 12-часов цикъл ден/нощ и вода и хранителни добавки ad libitum. Всички експерименти са извършени в съответствие с насоките на Националния здравен институт за използване на опитни животни и са одобрени от германското законодателство за защита на животните (код за разрешение K110/180‐07). Мишките се третират ежедневно с ЕРО (500 U/kg телесно тегло (т.т.)) чрез интраперитонеална инжекция или само носител. Животните бяха убити чрез цервикална дислокация след 2 и 5 седмици на зарастване на фрактури за радиологичен, биомеханичен и хистоморфометричен анализ (н = 8 всяка група). Еритроцитите, хемоглобинът и хематокритът бяха измерени в проби от цяла кръв в края на периода на наблюдение. Допълнителни животни бяха убити след 2 седмици за анализ на Western blot (н = 3 всяка група) и за анализ на циркулиращи ендотелни клетки-предшественици чрез поточна цитометрия (н = 6 всяка група).

Хирургична процедура

Мишките бяха упоени чрез интраперитонеална инжекция от 25 mg/kg телесно тегло ксилазин и 75 mg/kg телесно тегло кетамин. При стерилни условия беше направен 4 mm медиален парапателарен разрез на дясното коляно и пателата беше изместена странично. След пробиване на отвор (Ø = 0,5 mm) в интракондиларния прорез дистално сплескана 24G игла 4 се имплантира интрамедуларно и раната се затваря. След това средата на бедрената кост беше показана чрез страничен подход и направеният по поръчка клип с дължина 4 мм беше имплантиран вентро-дорзално в бедрената кост, както е описано по-горе. 5 С телена резачка Gigli е създадена остеотомия с размер на процепа 0,25 mm. Затварянето на рани завърши оперативната процедура.

Рентгенологичен анализ

В края на 2- и 5-седмичния период на наблюдение мишките се анестезират (25 mg/kg телесно тегло ксилазин и 75 mg/kg телесно тегло кетамин) и се правят вентро-дорзални рентгенови снимки на излекуваната фемора (MX-20D, Faxitron, Линкълншир, Илинойс). Диаметърът на калуса по отношение на диаметъра на бедрената кост (%) и плътността на калуса по отношение на ипсилатералната тибиална глава (%) бяха измерени с помощта на система за анализ на изображения (ImageJ, NIH, Bethesda, MD).

Биомеханичен анализ

Механично тестване беше извършено след отстраняване на имплантите. Контралатералната фемора служи като сдвоени контроли. Твърдостта на огъване се анализира, като се използва неразрушителен тест за огъване в три точки (1454 Цвик, Улм, Германия). Феморите бяха монтирани на триточковото устройство за тестване с страничната част на бедрената кост нагоре (работна дължина 6 mm). След това феморите се зареждат с постоянна скорост от 1 mm/min. Записва се кривата на деформация на товара и се изчислява твърдостта на огъване като линеен наклон на кривата на деформация на товара. Всички данни са дадени в проценти от контралатералната здрава бедрена кост.

Хистоморфометричен анализ

След резекция излекуваните фемори се фиксират в IHC цинков фиксатор (BD Pharmingen, Сан Диего, Калифорния) за 12–24 h, декалцифицират се в 10% разтвор на EDTA за 3 седмици и се влагат в парафин. Надлъжните разрези с дебелина 5 µm бяха изрязани и оцветени съгласно трихромния метод на Masson и Goldner. При увеличение от 1,25 × (Olympus BX60 Microscope, Olympus, Tokyo, Japan; Zeiss Axio Cam и Axio Vision 3.1, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany; ImageJ Analysis System, NIH) структурните индекси бяха изчислени според номенклатурата и мерните единици на препоръки на Американското общество за костни и минерални изследвания (ASBMR): (i) периостална калусна област [Pc.Ar (mm 2)]; (ii) максимален диаметър на калуса/диаметър на бедрената кост [Cl.Dm/F.Dm] и (iii) тъканно разпределение на костите, хрущялите и фиброзната тъкан в областта на калуса (%). Периосталната зона на калуса се определя от външния диаметър на калуса в радиална посока и 2 mm проксимално и дистално от процепа на счупване в аксиална посока. Освен това и двете корти са анализирани за преодоляване на костите на остеотомичната междина след 2 и 5 седмици.

Имунохистохимичен анализ

Западно петно

Калусната тъкан се замразява и съхранява при -80 ° C до по-нататъшна обработка. Образците бяха хомогенизирани и екстрахирани в лизисен буфер, състоящ се от 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,5% Triton-X 100, 0,02% NaN3, 0,2 mM PMSF и протеазен инхибитор коктейл (1: 100; Sigma, Taufkirchen, Германия). Протеините бяха разделени и прехвърлени в мембрани чрез стандартни протоколи и сондирани с помощта на анти-PCNA (1: 250; Dako Cytomation, Хамбург, Германия) и anti-NFkB (1: 300; Санта Круз, Хайделберг, Германия). Експресията на протеин се визуализира с помощта на усилена с луминол хемилуминесценция (ECL, GE Healthcare, Фрайбург, Германия) след излагане на мембраната на чувствителен на синя светлина авторадиографски филм (Hyperfilm ECL, GE Healthcare, Фрайбург, Германия). Сигналите бяха денситометрично оценени (Geldoc, софтуер Количество едно; BioRad, Hercules, CA) и нормализирани спрямо β-актиновите сигнали (миши моноклонални анти-β-актинови антитела, 1: 20 000; Sigma, St. Louis, MO), за да се коригира за неравномерно натоварване.

Поточна цитометрия

Периферна кръв на третирани с ЕРО животни и контроли се събира след 2 седмици. След лизис на пълна кръв и Fc блокада (Fc-Block, BD Pharmingen), жизнеспособната лимфоцитна популация беше анализирана за експресията на Sca-1-FITC (клон E13-1616.7, BD Pharmingen) и рецептор за съдов ендотелен растежен фактор-2 ( клон А3, Санта Круз), конюгиран със съответното маркирано с фикоеритрин вторично антитяло (Sigma, Сейнт Луис, МО), както е описано по-горе. 6, 7 съвпадащи с изотип антитела служат като контроли (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Едно- и двуцветни поточни цитометрични анализи бяха извършени с помощта на Becton Dickinson FACScan, оборудван с аргонов йон лазер. Данните бяха оценени от софтуера Cellquest.

Статистически анализ

Всички данни са дадени като средни стойности ± SEM. След изключване на ненормално разпределение на данните и доказване на предположението за еднаква дисперсия, сравнение между експерименталните групи беше извършено от студенти т-тест. За непараметрични данни е използван тест на Ман-Уитни. Статистиката беше извършена с помощта на GraphPad Prism 4.0 (Сан Диего, Калифорния). A стр- стойност

РЕЗУЛТАТИ

Хемоглобин

Концентрациите на хемоглобина са значително по-високи в проби от цяла кръв от третирани с ЕРО животни в сравнение с контролите за 2 седмици (19,0 ± 0,4 срещу 12,9 ± 0,2; стр

Рентгенологичен анализ

Представителни рентгенови снимки след 2 седмици на заздравяване на фрактурите са показани на Фигура 1. Диаметърът на околоочната калус е значително по-голям при третирани с ЕРО животни в сравнение с контролите (Фиг. 1 и 2А). Установено е обаче, че тази разлика е изчезнала след 5 седмици (фиг. 2Б). Рентгенологичната плътност на калуса е значително по-голяма при третирани с ЕРО животни след 2 и 5 седмици в сравнение с контролите (фиг. 2С, D).

Представителни рентгенови лъчи на дясната бедрена кост 2 седмици след фрактура и стабилизиране на контролна мишка (A) и третирано с ЕРО (B) животно. Обърнете внимание на повишеното образуване на калус след третиране с EPO. Лентата представлява 2 мм.

Радиологичен анализ на третирани с ЕРО животни и контролни средства, третирани с превозно средство. Диаметър на калуса спрямо диаметъра на бедрената кост (%) на 2 седмици (A) и 5 ​​седмици (B) след фрактура и стабилизиране. Плътността на калуса по отношение на плътността на ипсилатералната тибиална глава (%) също се дава на 2 седмици (C) и 5 ​​седмици (D) след фрактура и стабилизиране. Данните са дадени като средно ± SEM, *стр

Хистоморфометричен анализ

Хистоморфометричният анализ не показва разлики в диаметъра на периосталния калус (фиг. 3А, В) и областта на периосталния калус (данните не са показани) след 2 и 5 седмици. Анализът на състава на калуса на 2 седмици след фрактурата и стабилизирането разкрива, че третираните с ЕРО животни са имали значително повече кости и значително по-малко хрущяли и фиброзна тъкан в сравнение с контролите (фиг. 3С). След 5 седмици е установено, че тази разлика изчезва и периосталният калус и в двете групи се състои главно от кост (фиг. 3D). Интересното е, че след 2 седмици 2 от 8 третирани с ЕРО животни показват костно свързване на двете корти, в сравнение с нито едно от 8-те контролни животни. След 5 седмици 8 от 8, но само 4 от 8 контролни животни са били излекувани хистологично, както е показано чрез пълно преодоляване на костната междина на фрактурата (стр

Хистоморфометричен анализ на диаметъра на периосталната калус на 2 седмици (A) и 5 ​​седмици (B) след фрактура и стабилизиране. Панели C и D показват хистоморфологично анализирания състав на калуса, включително влакнеста тъкан (бяла), хрущял (сива) и кост (черна) на третирани с ЕРО животни и контроли на 2 седмици (C) и 5 ​​седмици (D) след фрактура и стабилизация. Данните са средни ± SEM (A и B) и средни (C и D); *стр

Имунохистохимичен анализ

Плътността на съдовете се анализира след 2 седмици в различни заздравяващи зони на калуса (периостална, централна, ендостална) чрез оцветяване на PECAM-1 (CD31) (Фиг. 4). Количественият анализ на плътността на съдовете в периосталната лечебна зона и централната лечебна зона не показва разлика между третираните с ЕРО животни и контролите (Фиг. 5В, С). Въпреки това, плътността на съдовете в зоната на заздравяване на ендостала е значително по-голяма при третирани с ЕРО животни в сравнение с контролите (фиг. 5А).

Представителни полета с висока мощност (HPF) на имунохистологични секции, оцветени за CD31 от различни лечебни зони в съюзи и несъюзи на ден 14 след фрактура и стабилизиране. Пръчките представляват 100 µm.

Количествен анализ на плътността на съдовете (съдове/поле с висока мощност (HPF)) след 14 дни при контроли (бели стълбове) и третирани с ЕРО животни (черни стълбове) в зоната на заздравяване на ендостала (A), централната зона на заздравяване (B) и зоната на заздравяване на периоста (C). Средно ± SEM; *стр

Биомеханичен анализ

След 2 и 5 седмици сковаността при огъване е значително по-голяма при третираните с ЕРО животни в сравнение с контролите (фиг. 6). След 5 седмици обаче средната твърдост на огъване от 57% и 32%, в сравнение със съответната контратерална бедрена кост, съответно при третирани с ЕРО животни и контроли, показва, че пълното възстановяване на биомеханичната компетентност все още не е постигнато.

Свиване на сковаността на дясната бедрена кост при третирани с ЕРО животни и контролни животни на 2 седмици (A) и 5 ​​седмици (B) след фрактура и стабилизиране. Данните са средни ± SEM; *стр

Анализ на Western Blot

Експресията на PCNA, която представлява индикатор за клетъчна пролиферация в фрактурния калус, не показва никакви разлики между двете групи (фиг. 7А). Експресията на NFκB обаче е значително намалена при третирани с ЕРО животни (фиг. 7В).

Експресия на PCNA (A) и NFκB (B) в периосталния калус на 2 седмици след фрактура и стабилизиране, както се анализира чрез Western blotting. Данните са средни ± SEM; *стр

Анализ на поточната цитометрия

На 2 седмици след фрактура и стабилизиране е установено, че броят на циркулиращите EPC (VEGFR2 +/Sca1 +) на 10 000 клетки е значително увеличен при третирани с ЕРО животни в сравнение с контролите (227,3 ± 19,20 срещу 148,3 ± 21,99; стр

ДИСКУСИЯ

Настоящото проучване за първи път показва, че лечението с ниски дози EPO значително подобрява заздравяването на малки сегментни костни дефекти при мишки. Това се показва от повишена скованост на огъване на заздравяващата фемора и увеличена рентгенова плътност на калуса след 2 и 5 седмици на заздравяване. Повишената радиологична плътност след лечение с ЕРО е в съответствие с нашите хистологични находки, които показват по-голям дял на костите в лечебния калус.

Малко се знае за действията на EPO по време на зарастване на фрактури. В други тъкани са описани различни механизми, чрез които ЕРО може да упражнява своите не-хематопоетични ефекти. При мозъчна исхемия и метаболитен стрес е доказано, че ЕРО влияе пряко върху клетките в лечебната тъкан чрез стимулиране на пролиферацията. По-нататък е доказано, че 12 ЕРО влияе върху локалната микросреда на мястото на увреждане, като намалява възпалението, 13 намалява некрозата, 14 модулира функциите на имунните клетки, 15 и набира стволови клетки. 16 В настоящото проучване тествахме дали EPO ускорява заздравяването чрез стимулиране на клетъчната пролиферация. Въпреки това, непроменената експресия на PCNA в калуса на третирани с ЕРО животни в сравнение с контролите не потвърждава тази хипотеза.

Взети заедно, ние демонстрираме, че дългосрочното лечение с EPO с ниски дози значително подобрява заздравяването на малки сегментни дефекти при мишки. Тъй като ЕРО е широко използвано лекарство с добре известен профил на безопасност, може да бъде от голям интерес използването на ЕРО в проспективни клинични проучвания при пациенти със забавено заздравяване на фрактури и несъединяване.

Благодарности

Оценяваме отличната техническа помощ на Джанин Бекер. Това проучване беше подкрепено с безвъзмездна помощ от фондация AO, Швейцария.