Оцеляване на киселите млечни бактерии в човешките черва

bg.waykun.com - Диета и загуба на тегло, днес

Марина Ели

AAT-Advanced Analytical Technologies S.r.l., 29100 Пиаченца, Италия, 1 Centro Ricerche Biotecnologiche, 26100 Кремона, Италия, 2 Danone Vitapole, Nutrivaleur, 91767 Palaiseau Cedex, Франция 3

Мария Луиза Калегари

Сузана Ферари

Елена Беси

Даниела Кативели

Сара Солди

Лоренцо Морели

Натали Гупил Фейлерат

Жан-Мишел Антоан

Резюме

Дали Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus могат да бъдат възстановени, след като преминаването през човешкото черво е било тествано чрез хранене на 20 здрави доброволци с търговско кисело мляко. Бактериите от кисело мляко са открити в човешките изпражнения, което предполага, че те могат да оцелеят при транзит в стомашно-чревния тракт.

Кисело мляко, определено като продукт на млечна ферментация от Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus, има дълга история на благоприятно въздействие върху благосъстоянието на хората. В няколко статии работниците са се фокусирали върху научно документираното въздействие само на културите кисело мляко върху метаболизма на червата (1, 23). Доказано е, че бактериите от кисело мляко подобряват храносмилането на лактоза при индивиди с непоносимост към лактоза (16, 17, 20, 21, 27), влияят върху времето за преминаване на червата (11) и стимулират имунната система на червата (2, 14, 31), въпреки че някои автори не успяха да потвърдят тези заключения (5, 6, 35). Изследвана е и имунологичната и генетична основа на имуностимулиращите свойства на закваските с кисело мляко (8, 15).

Независимо от това, научната основа на тези проучвания и прилагането на термина „пробиотик“ към началните бактерии L. delbrueckii subsp. bulgaricus и S. thermophilus все още се обсъждат силно (13, 33). Както е посочено от Guarner et al. (13), последните научни разработки оспориха валидността и полезността на ин витро критериите за подбор, традиционно предложени за пробиотици.

Традиционните предястия от кисело мляко имат нечовешки произход и те (особено стрептококи) страдат от излагане на стомашни киселинни условия (7) и имат умерена способност да се придържат към чревните епителни клетки (12).

Оцеляването по време на преминаване през стомашно-чревния тракт обикновено се счита за ключова характеристика на пробиотиците за запазване на очакваните им здравословни ефекти (3).

Има противоречиви проучвания относно възстановяването на L. delbrueckii subsp. bulgaricus и S. thermophilus от фекални проби след ежедневно поглъщане на кисело мляко. Някои автори съобщават, че L. delbrueckii subsp. bulgaricus и S. thermophilus не са възстановени от изпражненията на млади (9) и възрастни (26) субекти. От друга страна, Brigidi et al. (4) съобщават, че в продължение на 6 дни след края на лечението те са възстановили S. thermophilus от фекални проби от 10 здрави субекта, които са приемали фармацевтичен препарат през устата в продължение на 3 дни. Устойчивостта на култура на кисело мляко в човешките черва също беше потвърдена наскоро от Mater et al. (22), които са изследвали 13 здрави доброволци, хранени с кисело мляко, съдържащо резистентни на рифампин и стрептомицин щамове на S. thermophilus и L. delbrueckii subsp. bulgaricus.

Целта на това проучване беше да се изследва възстановяването на жизнеспособна L. delbrueckii subsp. bulgaricus и S. thermophilus от фекални проби от 20 здрави доброволци, хранени с търговско кисело мляко в продължение на 1 седмица.

Нашето проучване включва 10 мъже и 10 жени здрави субекти, чиято средна възраст е 32,3 години. Тези субекти са яли 125 g търговско кисело мляко (Bianco Naturale; Danone) два пъти дневно в продължение на 1 седмица. Доброволците, които бяха разделени на две групи от по 10 субекта, бяха изследвани веднъж, за да се определи устойчивостта на културите кисело мляко във фекални проби.

Две последващи опити (опити 1 и 2) бяха проведени с по 10 субекта. Доброволците трябваше да се въздържат от консумация на кисело мляко и пресни млечни продукти в продължение на 2 седмици преди началото на опитите. Ежедневният прием на бактерии от кисело мляко, съдържащ 2,4 × 10 7 CFU/g L. delbrueckii subsp. bulgaricus и 2,0 × 10 8 CFU/g от S. thermophilus, е около 6 × 10 9 CFU на L. delbrueckii subsp. bulgaricus и 5 × 10 10 CFU на S. thermophilus.

Фекалните проби, получени в началото на всяко изпитване (нулево време) и след 2 и 7 дни, се съхраняват за максимум 12 часа при 4 до 8 ° C. Проба от 1 g фекален материал се разрежда десетично в стерилен физиологичен разтвор и се поставя върху обезмаслено мляко (RSMA) (Difco, BD, Sparks, Md.) В опит 1. В опит 2 RSMA е допълнен с 0,05% рутениево червено багрило (Sigma, St. Louis, Mo.) за получаване на модифициран RSMA (m-RSMA). И в двата случая плаките се инкубират при 44 ° С в продължение на 48 часа.

В това проучване беше поставен голям акцент върху избора на среда, подходяща за надеждно и възпроизводимо откриване на лактобацили и стрептококи във фекалиите. Определена беше способността на RSMA да поддържа растежа на ясно различими колонии и ефективността на тази среда беше усъвършенствана чрез добавяне на рутениево червено багрило (24) (m-RSMA), което ни позволи ясно да различим белите ореоли на малкия ентерокок колонии от розовите ореоли на колониите Lactobacillus и Streptococcus. След продължителна инкубация при 44 ° C, колониите на m-RSMA плочи се променят от розово на фуксия за стрептококи и от старо розово до жълто за лактобацили, което ни позволи да предпечатаме фекалната микрофлора на лекуваните доброволци и да намалим броя на изолатите, които бяха идентифицирани чрез молекулярни инструменти.

Колонии, имащи морфологии, подобни на Lactobacillus и Streptococcus на дните 2 и 7, се репликират, като се използват 10% от колониите, възстановени от първата четлива плоча, върху среда MRS (Difco, Детройт, Мичиган) и среда LM17 (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Обединеното кралство), съответно, инкубира при 44 ° C в продължение на 48 часа и директно се лизира с MicroLYSIS (Microzone Ltd., Haywards Heath, West Sussex, United Kingdom). Лизираните суспензии бяха използвани като образци в специфични за вида и щама PCR.

L. delbrueckii subsp. bulgaricus и S. thermophilus щамове, които бяха използвани като контроли в амплификационни експерименти, бяха изолирани от търговско кисело мляко чрез нанасяне върху RSMA и техните таксономични идентичности бяха потвърдени с помощта на молекулярни инструменти.

Тристепенен протокол за идентификация беше използван за L. delbrueckii subsp. bulgaricus-подобни колонии, отглеждани на селективна среда, използвайки праймери SS1 и DB1 (10) за L. delbrueckii видове и праймери 34/2 и 37/1 (18) за L. delbrueckii subsp. bulgaricus и условията за колоездене, описани по-горе. Колонии от 2 и 7 ден, които дават очаквания размер на ампликон с PCR праймерите на Lick et al. (18) след това бяха анализирани чрез повтарящата се екстрагенна палиндромна PCR (Rep-PCR) техника, използвайки праймер GTG5, както е описано от Versalovic et al. (32), за да потвърди идентичността на фекалните изолати от субекти, които са консумирали кисело мляко и са приемали орално L. delbrueckii subsp. изолати на bulgaricus.

Двустепенен идентификационен протокол е използван за S. thermophilus-подобни колонии, който включва праймери нагоре и надолу по веригата на гена lacZ (19). След това изолатите, за които беше потвърдено, че са изолати на S. thermophilus, бяха анализирани чрез гел електрофореза с импулсно поле (PFGE) поради липсата на надеждни PCR праймери, които биха могли да разграничат тясно свързаните видове S. thermophilus и Streptococcus salivarius, присъстващи в устната кухина на човека ( 28, 34). Профилите на храносмиланите от SmaI хромозоми, получени, както е описано от O'Sullivan и Fitzgerald (25), бяха сравнени, за да се определят идентичностите на щама.

Използвани са инструменти за молекулярна биология за специфична за щама идентификация на перорално приложени щамове кисело мляко, изолирани от фекални проби, предварително поставени върху RSMA (опит 1) и m-RSMA (опит 2). Общото преброяване, получено на тези среди, води до максимална концентрация от 10 7 жизнеспособни клетки на g (прясно тегло) изпражнения и в двете опити преди консумация на кисело мляко (нулево време). Освен това, значително увеличение на броя, особено в проучване 2, се наблюдава след 1 седмица консумация на кисело мляко (ден 7) за 4 от 10 доброволци, чийто първоначален брой в тази среда е много нисък (около 10 3 CFU на g [прясно тегло ] на изпражненията).

Липсата на L. delbrueckii subsp. bulgaricus и S. thermophilus щамове от фекални проби, получени в нулево време, бяха изследвани и потвърдени (данните не са показани).

Възстановяване на жизнеспособни щамове кисело мляко в опит 1.

След 1 седмица лечение, 41 фекални изолати бяха подложени на PCR анализ със специфични за вида праймери на L. delbrueckii, което доведе до идентифициране на L. delbrueckii subsp. bulgaricus в 35 случая, включващи 6 от 10 доброволци, както е показано в Таблица Таблица1. 1. Броят на жизнеспособните L. delbrueckii subsp. bulgaricus CFU във фекални проби са показани в таблица Таблица2 2 .

МАСА 1.

Възстановяване на L. delbrueckii subsp. bulgaricus и S. thermophilus от фекални проби след поглъщане на кисело мляко

Популярен

Те четат сега