Резюме

Въведение

През последните 10 години появата на диабет тип 2 (T2D) се е увеличила със страшни темпове. Докато заседналият начин на живот и прехранването несъмнено допринасят за тази световна епидемия, вътрематочната среда на плода е допълнителен влиятелен участник в дългосрочното здраве. Всъщност няколко епидемиологични проучвания на човешки популации подчертават пряка връзка между вътрематочното забавяне на растежа (IUGR) и появата на инсулинова резистентност и T2D в живота на възрастни (1,2). Подобни наблюдения доведоха до концепцията за произхода на развитието на болестта при възрастни, която предполага, че ключовото програмиране на човешките разстройства произхожда от ранния живот (3,4).

майката

За да се разгадаят механизмите, залегнали в програмирането на заболявания на възрастни, са създадени няколко животински модела на IUGR (5). Въпреки разликите в естеството, времето и продължителността на вътрематочната обида, повечето модели на животинския IUGR дават сравними резултати. Един от най-широко изследваните модели използва ограничаване на протеините при майките при плъхове. Важно е, че тази ситуация проявява фенотипни прилики с човешкия IUGR, което е свързано с възрастово зависимо влошаване на глюкозния толеранс.

В патогенезата на T2D инсулиновата резистентност, свързана с β-клетъчна недостатъчност, води до хронична хипергликемия, определяща диабета. При IUGR при животни и хора, функционално нарушение в множество тъкани, включително мускули, мастна тъкан, черен дроб и панкреас, се случва по време на зряла възраст. Въпреки това, ендокринният панкреас изглежда най-силно засегнат в ранните етапи на развитие, което предполага, че в контекста на вътрематочните модификации T2D може да произхожда от дефекти в развитието на този орган.

Очевидно е, че всяко нарушение в околната среда на ендокринните клетки в рамките на даден период от време за развитие може да предразположи към T2D, дори през следващото поколение (6). Въпреки че последиците от неблагоприятната вътрематочна среда върху развитието на плода са документирани, молекулярните процеси, чрез които те възникват, едва започват да се появяват (7).

Интригуваща характеристика на произхода на развитието на болестта при възрастни се отнася до предаването на здравословното разстройство от поколение. Такова програмиране е свързано с промени в метилирането на ДНК и/или модификациите на хистон, засягащи генната експресия и допринасящи за тази клетъчна памет (8,9). Освен това, зависимата от хранителни вещества модулация на микроРНК (miRNAs) може също да предизвика податливост на болести и метаболитни усложнения при потомството. В действителност, мисекспресираните miRNAs участват в програмирането на мастната тъкан при плъхове със забавен растеж, причинявайки липотоксичност и инсулинова резистентност и следователно те повишават податливостта към метаболитни заболявания по време на зряла възраст (10).

Геномът на бозайниците кодира няколко стотици miRNAs, които регулират генната експресия чрез модулация на техните целеви mRNAs. Повечето от тези едноверижни 20–22-нуклеотидни дълги РНК взаимодействат със специфични последователности в 3 ′ нетранслираната област на иРНК. По този начин, miRNAs индуцират разграждане на mRNA и/или инхибиране на транслацията (11). Биологичното значение на miRNAs се демонстрира от разнообразните и дълбоки фенотипни последствия при промени в тяхната експресия. Тези промени са свързани с нарушено развитие и патологични ситуации. Всъщност miRNAs изглежда са основни регулатори на генната експресия в много биологични програми, включително развитието на органи и метаболизма (12-17). Изчислителните прогнози за миРНК цели оценяват, че една миРНК може да повлияе на гама от различни иРНК, което предполага, че голяма част от транскриптома е подложена на модулация на миРНК. Използвайки модел на плъхове на майчиното недохранване, тук разглеждаме хипотезата, че смущението на програмираната експресия на ключови miRNAs в ендокринния панкреас на потомството допринася за ефектите на ранното хранене върху установяването на β-клетъчната маса и, следователно, върху дългия -срочно здраве на организма.

Изследователски дизайн и методи

Животни и диети

Всички процедури бяха извършени в съответствие с насоките за грижа и използване на лабораторни животни от Френския национален институт по здравеопазване и медицински изследвания. Многоплодни женски плъхове Wistar с тегло 200–250 g (Janvier, Le Genest-Saint-Isle, Франция) се чифтосват през нощта с мъжки плъхове Wistar. Бременните жени са настанени индивидуално със свободен достъп до вода. Язовирите се хранят ad libitum по време на бременност и кърмене с контролна (20% тегл./Протеин) или изокалорична нискобелтъчна (LP) диета (8% тегл./Протеин; LP група) (Hope Farm, Woerden, Холандия) ( 18). След отбиването потомството на двете групи се хранеше със стандартна чау ad libitum. При всеки експеримент са анализирани минимум 3 котила на група.

Колекция островчета

Получени са неоформени фетални островни плъхове, както е описано по-горе (19). Накратко, панкреасите на 21-дневните плодове бяха отстранени асептично, смлени и смилани с колагеназа (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, Мисури). Разградените панкреаси се инкубират в продължение на 7 дни при 37 ° С във влажна атмосфера. Островчета от 3-месечни плъхове са получени, както е описано другаде (20). След центрофугиране с градиент на плътността, използвайки хистопак-1077 (Sigma-Aldrich), островчетата се измиват и подбират ръчно под стереомикроскоп. И накрая, те бяха или дисоциирани за експерименти за трансфекция (вж. Култура и трансфекция на дисоциирани островни клетки) или култивирани в среда RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY), допълнена с FBS (10% v/v) и Pen Strep (1% v/v).

Култура и трансфекция на дисоциирани островни клетки

Преди трансфекция, островчетата на плъхове се дисоциират чрез трипсинизация (0,5 mg/ml; Gibco) и се засяват в чашки на Петри с диаметър 60 mm, съдържащи 5 ml среда RPMI 1640 (Gibco), съдържаща FBS (10% v/v) и Pen Strep (1%) v/v). Клетките се инкубират в продължение на 16 часа при 37 ° С, за да се позволи пълно възстановяване. След това дисоциирани островни клетки бяха засяти с плътност 25 × 10 3 клетки/cm 2 върху 35-милиметрови ямки, покрити с 804G-ECM (подарък от Phillipe Halban, Женева, Швейцария).

Използвайки Lipofectamine 2000 (Invitrogen), 48 часа след посяването на дисоциирани островни клетки бяха трансфектирани със 100 nmol/L двуверижни РНК олигонуклеотиди, съответстващи на зрял miR-375 или инхибитор на miRNA шпилка, за да блокират ендогенния miR-375 (Thermo Scientific, Gometz-le -Чател, Франция). Клетките се анализират 72 часа след трансфекцията.

Имунохистохимични и морфометрични измервания

Панкреасите от фетуси и от 3-месечни плъхове са фиксирани в 3,7% (w/v) формалин, дехидратирани и вградени в парафин. Секции (5 μm) бяха събрани, обезпарафинирани и хидратирани в етанол и беше използван метод за извличане на антиген. Тъканите се проникват и инкубират в продължение на 30 минути с блокиращ разтвор, съдържащ BSA (3% w/v) преди инкубация през нощта с първични антитела (вж. Допълнителни данни). Следващите проби бяха инкубирани в продължение на 1 час при стайна температура с вторични антитела (вж. Допълнителни данни).

Всички измервания бяха извършени сляпо, за да се избегнат влиянията от очакванията на тестерите. На фетален ден 21 бяха анализирани минимум 3 секции (на всеки 150 µm) от всяко от 6 животни от 3 различни котила на група. Бяха анализирани минимум 6 среза (на всеки 150 µm) от всяко от 6 животни на група 3-месечни плъхове.

Измерват се инсулино-положителни и глюкагон-положителни области, за да се определят съответно β- и α-клетъчните фракции. Те бяха измерени като съотношение на инсулино-положителната и глюкагон-положителната клетъчна площ спрямо общата тъканна площ на цялата секция.

Разпределението на честотата на различни размери на островчета е измерено със софтуера ImageJ. Ние разглеждахме като остров клъстер от поне три инсулино-положителни клетки (21). За тяхното разпределение по размер островчетата бяха произволно класифицирани като малки (200 μm). Броят на островчетата във всеки клас се изразява като процент от общите островчета на група. Ако приемем, че клетките са сфери, диаметърът на отделните β-клетки е изчислен със софтуера ImageJ. За да се определи β-клетъчната пролиферация, панкреатичните срезове се оцветяват с антитела към фосфорилиран хистон Н3 и към инсулин и подходящи вторични антитела.

Екстракция на РНК и количествена RT-PCR

РНК от фетален панкреас и островни клетки се изолира, като се използва реагент TRIzol (Invitrogen). Общата РНК (1 μg) се транскрибира обратно в комплементарни ДНК (cDNA) и се анализира с помощта на SYBR Green (ABI PRISM 7000 Sequence Detector System). Количеството сДНК, използвано във всяка реакция, се нормализира към домакинския ген циклофилин А. Праймерите и условията за количествен PCR анализ са достъпни при поискване.

Профилиране на експресия на miRNA (анализ на miRNome)

Количественият анализ на PCR редица на miRNA беше извършен с помощта на rno-miRNome miRNA профилиращ комплект (System Biosciences, Mountain View, CA). РНК се извлича от отделни панкреаси на фетуси в контролната и LP групата. След това за масива се обединява РНК от минимум четири панкреаса на котило. Анализирани са три котила на група. На едно котило, 1 μg обединена РНК се транскрибира обратно в cDNA от първа верига, използвайки QuantiMir RT Kit (System Biosciences). Профилирането на зрели miRNAs се извършва на 3 литра на група чрез количествена PCR във формат с 384 ямки с плочи, включително 380 miRNA-специфични праймери и с помощта на SYBR Green. Експресионните нива са нормализирани с помощта на U6, тъй като кривата му на топене е по-задоволителна в сравнение с тази, получена за двата други референтни гена.

Създадена е топлинна карта с помощта на софтуер за анализ с отворен код с мултиекспериментен преглед (www.tm4.org). експресията на miR-375 е потвърдена с miRCURY LNA Universal RT MicroRNA PCR комплект (Exiqon, Vedbaek, Дания), съгласно инструкциите на производителя.

Анализ на общите клетъчни екстракти и Western Blotting

Фетален панкреас или отделени островни клетки са обработени за изолиране на протеини, както е описано от Dumortier et al. (22). За Western blotting 10–50 µg от общите протеини се разделят чрез електрофореза и се прехвърлят в поливинилиден дифлуоридни мембрани (Immobilon-P; Millipore, Bedford, MA). Имунореактивните протеини бяха разкрити чрез засилена хемилуминесценция (Millipore, Billerica, MA). Антитела към фосфоинозитид-зависима киназа-1 (PDK-1) е от Cell Signaling Technology (Danvers, MA), а антитялото към β-актин е от Sigma-Aldrich. Western blots са количествено определени чрез денситометрия, използвайки ImageQuant софтуер.

Анализ на секрецията на инсулин

Всички експерименти бяха проведени с модифициран разтвор на Krebs-Ringer, съдържащ 2,8 mmol/L глюкоза (23). Дисоциирани островни клетки или партиди от 20 свободно плаващи, съобразени по размер островчета се инкубират при 37 ° С в 1 ml среда Krebs-Ringer, съдържаща глюкоза в концентрация 2,8 или 20 mmol/L. След 120 минути инкубационната среда се отстранява, за да може да се измери инсулинът. Островчета или дисоциирани островни клетки се събират и хомогенизират чрез сонификация за извличане на инсулин. За да се елиминират вариациите, дължащи се на разликите в отделните партиди на островчета, секрецията на инсулин по време на инкубацията се изразява като процент от съдържанието на инсулин в островчета в началото на инкубацията, което се нарича фракционно освобождаване на инсулин.

Тестове за орална толерантност към глюкоза

След едно нощно гладуване, на потомството на плъховете в контролната и LP групата се дава орален глюкозен болус (2 g). Кръв се събира от опашната вена на 0, 15, 30, 60, 90 и 120 минути. Гликемията е измерена с помощта на глюкометър OneTouch (LifeScan Inc., Milpitas, CA).

Статистически анализ

Експресията на miRNA в панкреаса на феталния плъх се променя от майчината LP диета. A: Топлинна карта, показваща количественото определяне на 380 miRNAs, изразени във феталните панкреаси на потомство от контролната (C) и LP групата на 21-ия ден от бременността. Всяка колона представлява едно котило (група от четири плода). Количественият PCR анализ на miRNA е извършен за изследване на зряла експресия на miRNA в панкреасите на фетусите от контролната и LP групата. Б: 47-те най-диференцирано експресирани miRNAs в панкреаса от LP животни в сравнение с контролните животни.

PDK-1 протеинът е регулиран надолу в панкреатичните острови от потомство в групата LP

PDK-1, една от целите на miR-375 (24), е ключов компонент на сигналния път на инсулина и растежния фактор, след фосфоинозитид 3-киназата в каскадата протеин киназа В. Тъй като miR-375 е регулиран в панкреаса на плода в групата с LP, ние измерихме нивата на PDK-1 протеин в панкреасите на нашите експериментални групи. Използвайки Western blotting, не наблюдавахме разлика в общия PDK-1 при панкреаси от групата LP в сравнение с контролите (фиг. 2А), докато количественият PCR анализ разкри умерено намалено ниво на PDK-1 иРНК (фиг. 2В). Имунохистохимичните анализи обаче показват, че имунореактивността на PDK-1 е специфично намалена в ендокринното отделение на панкреаса (фиг. 2С).

Нивото на PDK-1 протеин е намалено във феталния ендокринен панкреас от групата LP на ден 21. A: Western blot анализ. Панкреасът от контролните (С) и плодовете от групата LP се събират и протеиновите екстракти се анализират с антитяло към PDK-1 или към β-актин. Количествените проби бяха определени с помощта на софтуера ImageQuant. Стойностите са средни стойности ± SEM (n = 6). B: Измерване на PDK-1 иРНК. Фетални панкреази се събират за екстракция на РНК. РНК екстрактите се транскрибират обратно и се анализират чрез количествена PCR. Експресията на гена се нормализира до нивото на транскрипт на циклофилин А (CyA). Стойностите са средни стойности ± SEM (n = 6). В: Откриване на протеин PDK-1 на участъци от феталния панкреас (кръгъл). Скала = 100 μm. Интензитетът на имунооцветяването от минимум 90 островчета на група беше оценен с помощта на софтуера ImageJ. Графиките показват ± SEM (n = 6 фетални панкреаси с по 3 слайда). ** P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Морфометрични параметри на β- и α-клетки при фетуси от контролни и LP язовири на 21 ден