научна статия

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Цитати
  • Метрика
  • Лицензиране
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

Резюме

Въведение

Агрегометрията за пропускане на светлина (LTA) се счита за златен стандартен метод за изследване на пациенти със съмнения за аномалии на първичната хемостаза поради наследени или придобити дефекти на функцията на тромбоцитите [1]. При този метод моделът на агрегация на тромбоцитите в отговор на агонист се измерва в богата на тромбоцити плазма (PRP) чрез турбидометрия [2]. В различни национални и международни насоки се посочва, че LTA играе важна роля в диагностичната работа на пациенти с тенденция към кървене [3 - 9]. Нови техники, базирани на анализ на цяла кръв, напр. импедансна агрегометрия и анализатор на тромбоцитната функция (PFA), са разработени, но те нямат чувствителност за откриване на леки нарушения на функцията на тромбоцитите [10, 11] или са само допълващи LTA, като поточна цитометрия [12]. По този начин LTA продължава да бъде един от най-полезните инструменти за оценка на съмнения за нарушения на функцията на тромбоцитите.

хармонизиране

Това проучване имаше три цели:

Да се ​​изследва дали използването на стандартизиран LTA протокол може да намали вариацията (на концентрация на агонист) като цяло чрез анализ на максималната агрегация при здрави доброволци.

Да се ​​изследва дали използването на стандартизиран протокол за LTA може да намали вариациите в пет болници, които са участвали както преди, така и след стандартизацията, чрез анализ на максималната агрегация при здрави доброволци.

Да се ​​изчислят национални референтни стойности за концентрация на агонист, като се използват резултатите от всички здрави доброволци след стандартизация.

Материали и методи

Участващи лаборатории

Общо 10 лаборатории (заедно, включително 129 здрави субекта) са участвали в проучването през 2013 г. (преди стандартизацията) и 11 лаборатории (134 здрави субекта) през 2016 г. (след стандартизация). Пет лаборатории участваха преди и след стандартизацията. Подробностите за участниците са обобщени в Таблица I.

Публикувано онлайн:

Таблица I. Броят на холандските лаборатории, участвали в това проучване преди и след въвеждането на стандартизиран протокол LTA, включително инструментите, използвани за агрегометрия.

Здрави субекти

Здравите доброволци бяха включени анонимно (без регистрация на възраст или пол) с единствените критерии за изключване на приема на лекарства, за които се знае, че пречат на функцията на тромбоцитите. Беше записана информация за гладуване, инструкции за диета и лека храна преди вземането на проби. Цитрирана кръв е взета от здрави доброволци съгласно местната венепункционна процедура, насоките CCKL/ISO-15189 и Декларацията на WMA от Хелзинки.

Инструменти

Повечето лаборатории използват един тип уреди за LTA, или Chrono-Log Corporation (Haverston, PA, USA), APACT, (LABiTec, Ahrensburg, Germany), PAP-8 (Biodata Corporation, Horsham, PA, USA) или Aggram (Helena BioSciences, Европа).

Видът на инструмента на участник е показан в таблица I.

Преди стандартизацията през 2013 г. всяка участваща лаборатория използва своя местен протокол за LTA, който няма да бъде посочен тук. Като цяло, 10 различни процедури за LTA бяха използвани в 10-те лаборатории в Холандия преди стандартизацията.

Разнообразието в концентрациите на реагентите през 2013 г. (преди стандартизацията) и фиксираните концентрации, използвани след стандартизацията през 2016 г., е обобщено в таблица II.

Публикувано онлайн:

Таблица II. Концентрации на агонисти, използвани преди (2013) и след (2016) стандартизация.

През 2016 г. беше одобрен националният протокол VHL, базиран на протокола SSC-ISTH съгласно Cattaneo et al. [18]. Протоколът описва предварително аналитични променливи по отношение на вземането на кръв и подготовката на проби, настройките на центрофугите, агрегометричните устройства и настройки, които са обобщени в допълнителни таблици S1 и S2.

Използваните марки реактиви не са регистрирани през 2013 г., а реагентите, използвани през 2016 г., са обобщени в допълнителна таблица S3.

Статистика

Данните бяха анонимизирани преди импортиране в база данни и анализирани с помощта на GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software). Различията в резултатите от LTA при здрави индивиди (които обикновено не се разпределят) между 2013 и 2016 бяха тествани по значимост с непараметричен U-тест на Mann-Whitney. Референтните интервали (95% интервал, нормално разпределени) бяха определени чрез параметрични анализи с помощта на EP-оценител (Data Innovations LLC).

Резултати

Общо изменение в максималната агрегация на здрави доброволци преди и след въвеждането на стандартизиран протокол за LTA

Фигура 1а-i демонстрира наблюдения на вариацията в максималната агрегация на тромбоцитите с различни концентрации на ADP, колаген, ристоцетин, епинефрин и арахидонова киселина при здрави доброволци преди и след стандартизация с помощта на различни анализатори. Концентрациите на ADP от 0,5 до 2,5 μM (Фигура 1а) показват като цяло високи коефициенти на вариация (CV) в максимална агрегация, варираща от 5% до 107%, когато се измерва на всички инструменти (Фигура 1а). Използването на стандартизиран протокол (2 μM ADP) не намалява CV. Най-ниска вариация се наблюдава преди стандартизацията, когато се използва малко по-високата концентрация на ADP от 2,5 μM. Фигура 1b, c показва, че увеличаването на концентрациите на ADP (5 или 10 µM) намалява CV без разлика преди или след стандартизацията. Междинните или високите концентрации на ADP показват малка вариабилност между различните анализатори по отношение на максималните диапазони на агрегиране.

Публикувано онлайн:

Фигура 1. Промени в резултатите от LTA на здрави доброволци на различни анализатори преди и след стандартизацията. Графиките показват типа на инструмента (a: Chronolog, b: PAP8, c: APACT, d: AggRAM), лабораторния номер и коефициента на вариация (CV,%) в максимална агрегация след стимулиране на PRP от здрави субекти с: a) 0,5 –2,5 µM ADP нисък обхват, b) 4–5 µM ADP междинен обхват, c) 10–20 µM ADP висок обхват, d) 0,2–2 µg/ml колаген нисък обхват, e) 4–10 µg/ml колаген висок обхват, f) 0,25–0,6 mg/ml нисък диапазон на ристоцетин, g) 1,0–1,5 mg/ml висок диапазон на ристоцетин, h) 5 µM епинефрин, i) 0,5–1,6 mM арахидонова киселина. Резултатите се изразяват като% от максималната агрегация.

Фигура 1. Промени в резултатите от LTA на здрави доброволци на различни анализатори преди и след стандартизацията. Графиките показват типа на инструмента (a: Chronolog, b: PAP8, c: APACT, d: AggRAM), лабораторния номер и коефициента на вариация (CV,%) в максимална агрегация след стимулиране на PRP от здрави субекти с: a) 0,5 –2,5 µM ADP нисък обхват, b) 4–5 µM ADP междинен обхват, c) 10–20 µM ADP висок обхват, d) 0,2–2 µg/ml колаген нисък обхват, e) 4–10 µg/ml колаген висок обхват, f) 0,25–0,6 mg/ml нисък диапазон на ристоцетин, g) 1,0–1,5 mg/ml висок диапазон на ристоцетин, h) 5 µM епинефрин, i) 0,5–1,6 mM арахидонова киселина. Резултатите се изразяват като% от максималната агрегация.

Публикувано онлайн:

Фигура 1. продължение

Фигура 1. продължение

Горе-долу същия ефект се наблюдава и при колагена. Преди стандартизацията през 2013 г., ниските концентрации на колаген (0,2–2 μg/mL) показват повече вариации в максималните резултати от агрегиране на здрави доброволци в сравнение с високите концентрации на колаген (4–10 μg/mL) както на Chronolog, така и на APACT инструменти (Фигура 1d, д). След стандартизацията през 2016 г., ниските концентрации на колаген (1-2 μg/ml) показват по-малка вариабилност в максималната агрегация на всички инструменти, в сравнение с резултатите от LTA от 2013 г. (Фигура 1г). Фиксирана, висока концентрация на колаген от 5 μg/ml показва приблизително същата вариация преди и след стандартизацията (Фигура 1д). Както се очаква, ниските концентрации на ристоцетин водят до много ниски максимални реакции на агрегиране с няколко отклонения (Фигура 1F). Процедурата по стандартизация не засяга тези резултати. По-високите концентрации на ристоцетин показват CV варира от 3% до 19% преди и 3-22% след стандартизация (Фигура 1g). За епинефрин 5 цМ CV преди стандартизацията е по-ниска (Фигура 1h). И накрая, резултатите от LTA на арахидонова киселина са относително стабилни между различните инструменти преди и след стандартизацията (Фигура 1i).

Наблюдателни промени в резултатите от LTA за пет отделни болнични лаборатории, които са участвали както преди, така и след стандартизация

Фигура 2а илюстрира последиците от стандартизацията на LTA с междинни дози ADP за пет отделни болнични лаборатории, участвали в двете проучвания. Разликата в максималната агрегация на болнична лаборатория 2 и 6 не показва очевидна промяна между 2013 и 2016 г. Стандартизацията ясно увеличава вариацията в максималната агрегация с междинни концентрации на ADP в болница 7. За разлика от това вариабилността е намалена както в болница 8, така и в 9 след стандартизация през 2016 г. Фигура 2b показва резултатите от стандартизацията на LTA с ниски концентрации на колаген за същите пет болници. Очевидно стандартизацията намалява вариациите в максималната агрегация с ниски дози колаген в 4 от 5 болнични лаборатории.

Публикувано онлайн:

Фигура 2. Последицата от стандартизацията за пет отделни болници, участвали преди и след стандартизацията. Диаграмите показват вариации в максималната агрегация след стимулиране на PRP от здрави индивиди с а) 4-5 µM ADP или б) 1-2 µg/ml колаген. Резултатите се изразяват като% от максималната агрегация.

Фигура 2. Последицата от стандартизацията за пет отделни болници, участвали преди и след стандартизацията. Диаграмите показват вариации в максималната агрегация след стимулиране на PRP от здрави индивиди с а) 4-5 µM ADP или б) 1-2 µg/ml колаген. Резултатите се изразяват като% от максималната агрегация.

Определяне на общите референтни диапазони

Референтните интервали (95% доверителни интервали, нормално разпределени) за максимална агрегация, изразена като процент, за всеки агонист, бяха изчислени, като се използват данните LTA от всички здрави контроли (Таблица III). За отговорите на отделни агонисти общият брой на тестваните проби варира от 42 до 107.

Публикувано онлайн:

Таблица III. Референтни интервали на LTA (95% доверителен интервал, нормално разпределен) за% максимална агрегация на концентрация на агонист след стандартизация.

Максималният агрегационен отговор на ниски концентрации (2 μM) на ADP при здрави доброволци показва много широк спектър от резултати (Таблица III). Обаче се наблюдава по-малка вариабилност при междинни (5 μM) и високи (10 μM) концентрации на ADP. Това също отчита ниските и високите дози колаген и ристоцетин, епинефрин и арахидонова киселина (Таблица III).

Дискусия

В днешно време LTA все още е най-разпространеният метод, използван в клиничните лаборатории за оценка на функцията на тромбоцитите и се счита за златен стандартен метод за откриване на тромбоцитопатия [23 - 26]. Въпреки това, (пред) аналитичните аспекти на този метод все още не са стандартизирани в световен мащаб [15 - 17], въпреки различните усилия на експерти, участващи в разработването на национални или международни насоки [18 - 22]. Разработват се нови техники, напр. цитометрия на цял кръвен поток [12, 27]. Освен това, обещаващи резултати се постигат с проучвания за агрегиране на тромбоцити при условия на потока [28]. Предимствата на тези нови методи са използването на пълна кръв и ниската подготовка на пробите, но те също изискват обучени техници и специализирано оборудване [29 - 34]. По същия начин стандартизацията на традиционния LTA метод все още е от съществено значение тук.

За разлика от ADP, ниските дози колаген показват подобрение във варирането на резултатите от LTA след стандартизация. Предполага се, че това е така, защото не всяка лаборатория е използвала един и същ колагенов препарат преди стандартизацията през 2013 г. Разликите между говежди и еднокопитни колагенови препарати в LTA са описани по-рано и биха могли да бъдат източник на отклонения [37]. По същия начин арахидоновата киселина показва по-малко вариации в максималните резултати от агрегиране след стандартизация. Това не може да бъде обяснено. В случай на епинефрин не се наблюдава значителен ефект от стандартизацията.

Ползите от стандартизацията за отделна лаборатория присъстваха, но варираха. Използването на фиксирана концентрация на ADP нямаше предимно ефект и не доведе до намаляване на вариациите в повечето болници. Като цяло имаше по-малко вариации в резултатите от LTA с фиксирана концентрация на колаген след стандартизация. В заключение, вариацията не беше еднозначно намалена след стандартизацията, като се предположи, че има спазване на протокола.

Възможно обяснение за факта, че като цяло има ниско намаление на вариациите след стандартизацията, може да бъде ефектът от въвеждането на некоригиран PRP, който беше основна промяна за лабораториите след стандартизацията. Разреждането на PRP с бедна на тромбоцити плазма за коригиране на броя на тромбоцитите въвежда артефакти, както се предлага от Cattaneo et al. и трябва да се избягва, тъй като артефактивно инхибира агрегацията на тромбоцитите [18, 38]. В допълнение, това може също да доведе до повече вариации поради различен брой тромбоцити в PRP [39, 40]. Въпреки това, работата с некоригиран PRP може също да доведе до вариации между здрави доброволци. Друго проучване показва, че LTA с коригиран PRP брой на тромбоцитите е по-добър от естествения PRP за откриване на нарушения на кървенето, въпреки че ползата е малка и може да не е клинично значима [41]. От друга страна, Althaus et al. [36] използва също некоригиран PRP и публикува по-ниски CV при здрави PRP в сравнение с нашите констатации.

Ограничение на нашето проучване е, че здравите контролни субекти се различават през 2013 г. (преди стандартизация) и 2016 г. (след стандартизация). Освен това има ограничени данни за някои агонисти, напр. по-малко от 10 донора на болница. Това прави изследванията ни в голяма степен наблюдателни. Ние изследвахме само здрави доброволци, а не пациенти с тромбоцитопатии. Предимствата на стандартизацията могат да бъдат по-големи при тази целева популация; пациент, заподозрян в нарушение на кървенето.

Насоките CLSI изискват минимум 120 нормални субекта, за да се установят референтни интервали. За техника като LTA това е скъпо, трудоемко и невъзможно за всяка отделна лаборатория. Предложените диапазони в таблица III могат да дадат насоки за лабораториите и са директни. Всяка лаборатория трябва да реши и да обоснове дали може да използва тези стойности в ежедневната грижа за пациента.

Взети заедно, нашите открития илюстрират, че стандартизацията на LTA процедурите не води непременно до по-малко вариации, особено при ниски концентрации на агонист. За повечето концентрации на агонисти (междинен и висок ADP, нисък и висок колаген, нисък и висок ристоцетин, епинефрин и арахидонова киселина) вариабилността намалява при здрави индивиди. VHL все още насърчава всички потребители на LTA да се придържат към новите насоки.

Таблица I. Броят на холандските лаборатории, участвали в това проучване преди и след въвеждането на стандартизиран протокол LTA, включително инструментите, използвани за агрегометрия.