Rui Li 1, Jingzhi Li 3, Yiji Huang 1, Hui Li 2, Sishan Yan 1, Jiaxin Lin 1, Ying Chen 1, Limin Wu 4, Bing Liu 1, Genshu Wang 2, Tian Lan 1

неалкохолен

1. Катедра по фармакология, Фармацевтично училище, Фармацевтичен университет Гуангдонг, Гуанджоу 510006, Китай.
2. Катедра по чернодробна хирургия и център за трансплантация на черен дроб на Трета свързана болница, Университет Сун Ятсен; Гуанджоу 510630, Китай.
3. Училище за медицински сестри, Фармацевтичен университет Гуангдонг, Гуанджоу 510006, Китай.
4. Guangdong ShowYong Nature Medical Technology Co., Ltd., Foshan 528000, Китай

Цитат:
Li R, Li J, Huang Y, Li H, Yan S, Lin J, Chen Y, Wu L, Liu B, Wang G, Lan T. Polydatin отслабва индуцирания от диета неалкохолен стеатохепатит и фиброза при мишки. Int J Biol Sci 2018; 14 (11): 1411-1425. doi: 10.7150/ijbs.26086. Достъпно от https://www.ijbs.com/v14p1411.htm

Обхват: Безалкохолният стеатохепатит (NASH) се характеризира с натрупване на липиди в хепатоцитите и възпалителна клетъчна инфилтрация.

С оглед на антиоксидативните и противовъзпалителни ефекти на полидатина, настоящото проучване има за цел да изследва фармакологичните ефекти на полидатина върху NASH и свързаната с него фиброза.

Методи: Мишките C57BL/6 бяха хранени с диета с дефицит на метионин-холин (MCD), за да предизвикат NASH и фиброза на черния дроб, и третирани със или без полидаттин (5 mg/kg, през ден, i.p) в продължение на 4 седмици. HepG2 клетки, индуцирани от палмитинова киселина (PA), се третират с полидатин.

Резултати: Повишаването на съдържанието на серумна аланин аминотрансфераза (ALT) и аспартат аминотрансфераза (AST), активна каспаза-3, TUNEL-положителни клетки и триглицериди е намалено чрез лечение с полидатин. В допълнение, прилагането на полидатин на MCD-хранени мишки намалява оксидативния стрес чрез регулиране надолу на NOX4 ензими. Освен това, намаляването на възпалението и активирането на CD68 макрофаги корелира с инхибиране на пътно-подобен рецептор (TLR) -4/NF-κB p65 сигнален път чрез лечение с полидатин. Полидатинът също така намалява липидното натрупване, възпаление и апоптоза в HepG2 клетки, предизвикани от палмитинова киселина (PA), комбинирана с или без липополизахарид (LPS). И накрая, намаляването на чернодробната фиброза чрез лечение с полидатин съответства на намаляване на чернодробната генна експресия на фиброзни маркери.

Заключения: Тези резултати предполагат, че полидатинът предотвратява NASH и фиброзата чрез инхибиране на оксидативния стрес и възпаление, подчертавайки полидатина като потенциално терапевтично средство за профилактика и лечение на NASH.

Ключови думи: Polydatin, NASH, възпаление, оксидативен стрес, апоптоза, чернодробна фиброза.

Освен оксидативен стрес, възпалението също играе важна роля в NASH. Повишени нива на липополизахарид в кръвта (LPS), добре известен индуктор на възпаление, често се наблюдават при пациенти с NASH [4, 5]. Toll-подобен рецептор 4 (TLR4) е разпознаващ образец рецептор за LPS и индуцира активирането на вродена имунна сигнализация чрез адаптерни протеини MyD88 и TIR-домейн, съдържащи адаптер-индуциращ интерферон-b (TRIF) [6]. Предишни проучвания ясно са проверили критичните роли на TLR4 и MyD88 за насърчаване на NASH и свързаната с него фиброза [7, 8]. Тези резултати добре демонстрираха съответните роли на сигнализирането на TLR4 и ROS при насърчаването на прогресията на NASH.

Полидатинът, ресвератролов глюкозид (ресвератрол-3-О-β-моно-D-глюкозид), е активен компонент, изолиран от корените на Polygonum с cuspidatum Sieb. et Zucc. За разлика от ресвератрола, който пасивно прониква в клетките, полидатинът навлиза в клетките чрез активен механизъм, използвайки глюкозен носител [9]. Освен това, полидатинът е по-устойчив на ензимно окисляване от ресвератрола и притежава много по-добра разтворимост във вода.

По-рано установихме, че полидатинът предпазва от чернодробна фиброза при мишки чрез инхибиране на оксидативен стрес и възпаление. Наскоро една група предположи, че полидатинът може да подобри индуцирания от диетата NAFLD при плъхове чрез инхибиране на инсулиновата резистентност и липидния метаболизъм [10, 11]. Въпреки това, терапевтичната роля на полидатина в индуцирания от метионин и холин (MCD) чернодробен стеатохепатит и фиброза, както и неговият основен механизъм, особено свързан с антиоксидантната и противовъзпалителната функция, не е ясно определена. Следователно това проучване оценява ефектите на полидатин върху стеатохепатит и фиброза при мишки, индуцирани от MCD диета и HepG2 клетки, индуцирани от палмитинова киселина (PA).

Материали и реактиви

Животни и лечение

Всички процедури с животни са проведени в съответствие с китайското законодателство за хуманно отношение към животните и са одобрени от Комитета по етика за грижа и използване на лабораторни животни във фармацевтичния университет в Гуангдонг (Гуанджоу, Китай). Мишки C57BL/6 (28 мъжки, 10-седмични, 25-27 g) са закупени от Център за експериментални животни от провинция Гуангдонг, Китай. Мишките бяха настанени в контролирана температура (22 ± 2 ° C) при стандартни 12 часа светлина/тъмни условия и получиха храна и вода ad libitum. Мишките бяха хранени с диета с дефицит на метионин-холин (MCD) в продължение на 4 седмици, за да индуцират NASH (n = 10). Мишките бяха хранени с добавка на метионин и холин (MCS) като контрола (n = 8). В третираната група (n = 10), мишките бяха инжектирани интраперитонеално с полидатин (5 mg/kg, разтворен във физиологичен разтвор) след всяка индуцирана MCD диета. Мишки в нетретирани групи се прилагат със същия обем физиологичен разтвор като контрола на носителя.

Серумна биохимия

Серумните нива на аланин аминотрансфераза (ALT), триглицериди (TG) и аспартат аминотрансфераза (AST) са измервани с помощта на стандартни ензимни процедури в съответствие с инструкциите на производителя (Институт по биоинженерство в Нанкин Джианчен, Нанкин, Китай).

Анализ на хидроксипролин

Съдържанието на чернодробен хидроксипролин се измерва с помощта на търговски комплект за анализ на хидроксипролин в съответствие с инструкциите на производителя (Институт по биоинженерство в Нанкин Jiancheng, Нанкин, Китай). Накратко, чернодробните проби се хидролизират при 95 ° С в продължение на 20 минути, след това се коригират до рН 6,5 и се филтрират през активен въглен. След центрофугиране супернатантата се смесва с детектираща течност и се инкубира при 60 ° С в продължение на 15 минути. И накрая, пробите бяха измерени с помощта на четец за микроплаки при 550 nm.

Анализ на активността на Caspase3

Активността на чернодробната каспаза3 се измерва, като се използва комплект за анализ на активността на каспаза3, съгласно инструкциите на производителя (Bestbio, Китай). Накратко, чернодробните тъкани се смилат и центрофугират при 12000 rpm, супернатантата се открива при 405nm.

Клетъчна култура и лечение

Клетъчна линия на човешки хепатоцелуларен карцином HepG2 (Шанхайски институт по биохимия и клетъчна биология, Шанхай, Китай) се култивира в клетки DMEM, допълнени с 10% фетален говежди серум и 1% пеницилин-стрептомицин в 5% CO2 инкубатор при 37 ° С. Основните разтвори на 5 mM палматова киселина (PA)/5% BSA се загряват в продължение на 15 минути при 55 ° С и се охлаждат до стайна температура, за да се получи PA-BSA комплекс. Сместа PA-BSA се добавя към серум-съдържаща среда за клетъчна култура до крайна концентрация 250 μM. Клетките са гладували в безсерумен DMEM в продължение на 12 часа, последвано от PA индукция за допълнителни 24 часа в отсъствие или присъствие на полидатин (5, 10, 20 цМ)). HepG2 клетки, поддържани в хранителна среда, съдържаща 5% BSA, служат като контрола. Лактат дехидрогеназата (LDH) и триглицеридите (TG) бяха измервани при използване на стандартни ензимни процедури в съответствие с инструкциите на производителя (Институт по биоинженерство в Нанкин Jiancheng, Нанкин, Китай).

Western blot анализ

Чернодробните тъкани или клетки се лизират в RIPA буфер. Лизатите се центрофугират (12 000 х g за 20 минути при 4 ° С) и супернатантата се събира. Равни количества от общите протеини (30 ug) се фракционират чрез SDS-PAGE и след това се прехвърлят върху мембрани от поливинилиден дифлуорид (PVDF) (Millipore Corp, Bedford, MA, USA). След блокиране с 5% обезмаслено мляко в Tris-буфериран физиологичен разтвор с Tween-20 за 1 h при стайна температура, мембраните се инкубират с първични антитела при 4 ˚C за една нощ, последвано от инкубация с вторични антитела (1: 5000 разреждания) за 1 час при стайна температура. Лентите бяха открити чрез подобрен хемилуминесцентен (ECL) метод (Bio-Rad, САЩ) и уловени чрез хемилуминесцентна система (New Life Science Products, Бостън, Масачузетс, САЩ).

Хистопатология

Чернодробната тъкан беше фиксирана в 10% формалин, вградена в парафин, разделена и оцветена с хематоксилин и еозин (H&E), съгласно стандартна процедура. Хистологичното оценяване на чернодробните лезии се оценява хистологично чрез оценка на активността на NASH (NAS), както е описано [26]. NAS включва оценки на три хистологични характеристики: стеатоза (0-3), хепатоцелуларен балон (0-2) и лобуларно възпаление (0-3). Пробите с резултати> 5 бяха обозначени като „NASH“, а пробите с резултат - ΔΔCt). GAPDH се използва като вътрешен контрол. Последователностите на PCR праймерите са обобщени в Таблица 1.

Поточен цитометричен анализ на апоптозата

За оценка на апоптозата е използван комплект за откриване на апоптоза на флуоресцеин изотиоцианат (FITC) анексин-V (Keygentec, Китай) съгласно инструкциите на производителя. HepG2 клетки се култивират в 6-ямкови плаки в продължение на 24 часа, последвано от инкубация с носител, РА или полидатин. След 24 часа HepG2 клетките се събират и промиват със студен PBS. Клетките бяха ресуспендирани в 1 ml от 1 х свързващ буфер. Ресуспендираните клетки (100 µl) се прехвърлят в 5 ml епруветка за култивиране и се добавят анексин V-FITC (5 µl) и пропидиев йодид (PI, 5 µl). Клетките бяха завихрени и инкубирани за 15 минути на тъмно. Към всяка епруветка се добавя свързващ буфер (400 μl). Провежда се цитометричен анализ на потока веднага след оцветяването. Събирането и анализът на данни бяха извършени с флуоресцентен активиран клетъчен скенер (FACS) поточен цитометър (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Клетките в ранните стадии на апоптоза са били Анексин V-положителни и PI-отрицателни, докато клетките в късните етапи на апоптоза са били положителни както за Анексин V, така и за PI. PI оцветява некротичните клетки.

Статистически анализ

Всички експерименти са проведени поне три пъти и резултатите са изразени като средно ± стандартно отклонение (SD). Статистическите разлики между две групи бяха анализирани от несдвоените ученици т тест и разликите между множество групи данни са анализирани чрез еднопосочен ANOVA с корекция на Bonferroni (GraphPad Prism 5.0). P ## стр ### стр #### стр * стр ** стр **** стр # стр ### стр #### стр * стр ** стр # стр #### стр * стр ** стр *** стр # стр ## стр #### стр * стр ** стр *** стр # стр ## стр ### стр #### стр * стр ** стр *** стр # стр ## стр ### стр #### стр * стр ** стр *** стр ### стр #### стр * стр **** стр # стр ## стр ### стр #### стр * стр ** стр *** стр * стр *** стр **** стр

Получено 2018-3-15
Приет 2018-7-8
Публикувано 2018-7-30