Резюме

Цели/хипотеза

Биологичният механизъм, чрез който затлъстяването предразполага към инсулинова резистентност, е неясен. Една хипотеза е, че по-големите мастни клетки нарушават метаболизма чрез повишена липолиза. Докато проучванията показват, че размерът на клетките се увеличава пропорционално на ИТМ, не е ясно показано, че размерът на мастните клетки, независимо от ИТМ, е свързан с инсулинова резистентност. Целта на това проучване беше да се тества това широко разпространено предположение чрез сравняване на разпределението на размера на мастните клетки при 28 еднакво затлъстели, иначе здрави индивиди, които представляват екстремни краища на спектъра на инсулинова чувствителност, както е определено от модифицирания тест за инсулинова супресия.

Предмети и методи

Подкожни проби от биопсия на перибилибилна мастна тъкан се фиксират в осмиев тетроксид и се прекарват през Beckman Coulter Multisizer за получаване на разпределение на размера на клетките. Инсулиновата чувствителност се определя количествено чрез модифицирания тест за потискане на инсулина. Количествена PCR в реално време за гени за диференциация на мастните клетки е извършена за 11 субекта.

Резултати

Всички индивиди показват бимодално разпределение на размера на клетките. Противно на очакванията, средният диаметър на по-големите клетки не се различава значително между чувствителните към инсулин и инсулинорезистентните индивиди. Нещо повече, инсулиновата резистентност се свързва с по-високо съотношение на малки към големи клетки (1,66 ± 1,03 срещу 0,94 ± 0,50, стр = 0,01). Подобно разпределение на размера на клетките се наблюдава за изолирани мастни клетки. Резултатите от PCR в реално време показват два до три пъти по-ниска експресия на гени, кодиращи маркери за диференциация на мастните клетки (активиран от пероксизома пролифератор рецептор γ1 [PPARγ1], PPARγ2, GLUT4, адипонектин, стерол рецепторен елемент, свързващ протеин 1c) в инсулиноустойчив сравнение с чувствителни към инсулин индивиди.

Заключения/тълкуване

Тези резултати показват, че след контролиране на затлъстяването инсулиновата резистентност се свързва с разширена популация от малки мастни клетки и намалена експресия на маркери за диференциация, което предполага, че увреждането на диференциацията на мастните клетки може да допринесе за свързаната със затлъстяването инсулинова резистентност.

Въведение

Въпреки всички доказателства [1–6], сочещи, че излишното затлъстяване е свързано с нарушаване на усвояването на глюкоза, медиирано от инсулин в мускулите, клетъчните/метаболитни механизми, които обясняват как увеличаването на мастната маса води до това разстройство, не са ясни. Липсата на яснота относно механистичната връзка между повишената мастна маса и инсулиновата резистентност на мускулите се допълва от доказателства, че не всички индивиди с наднормено тегло/затлъстяване са устойчиви на инсулин и че еднакво затлъстелите индивиди могат да бъдат чувствителни към инсулин, както и резистентни към инсулин [7– 10].

Една предполагаема връзка между затлъстяването и мускулната инсулинова резистентност е начинът, по който мастните клетки разширяват капацитета си за съхранение на мазнини. Изследвания, датиращи от 70-те години на миналия век, оценяват размера на мастните клетки по отношение на затлъстяването, показвайки, че затлъстелите индивиди с увеличени подкожни коремни мастни клетки са по-склонни да бъдат хиперинсулинемични и непоносими към глюкоза, отколкото индивиди с по-малки мастни клетки [11–18]. Тези открития доведоха до схващането, че хората с хипертрофично, за разлика от хиперпластичното, затлъстяване са по-склонни да бъдат резистентни към инсулин и да развият диабет [12].

Въпреки това, в тези проучвания бяха преброени всички мастни клетки и извлечен общ липид, за да се определи средният размер на клетките [18]. Освен това в повечето проучвания липсват контролни субекти, съответстващи по отношение на ИТМ, очевиден фактор за наблюдаваните асоциации. Използвайки по-новата Beckman Coulter (Miami, FL, USA) Multisizer технология и софтуер, ние отбелязахме, че мастната тъкан на мастните плъхове Zucker показва сложно разпределение на размерите на мастните клетки, изглежда, че включва популации от малки и големи клетки, така че определянето от средния диаметър на клетките не описва адекватно клетъчната популация (DG Hunt, X. Chen, M. Santos, N. Tserentsoodol, S. Cushman; непубликувани данни). Въз основа на тези наблюдения решихме да проучим допълнително връзката между размера на мастните клетки и инсулиновата резистентност. Нашето проучване се различава от предишните проучвания по това, че (1) измерихме размера и разпределението на клетките, използвайки технологията Multisizer, и (2) нашата експериментална популация се състоеше от умерено затлъстели индивиди, които бяха или много инсулиноустойчиви, или много инсулиново чувствителни, но съвпадащи по отношение на ИТМ.

Предмети и методи

Субекти

Концентрациите на глюкоза в плазмата, инсулин и липиди/липопротеини се измерват след бърза нощ, както е описано по-горе [20, 23]. Други експериментални измервания включват тегло; височина; ИТМ, изчислен като тегло в килограми/(височина в метри) 2; обиколка на талията, измерена в края на издишването като точка по средата между илиачния гребен и долния крайбрежен ръб; аеробни упражнения, изразени като мин/седмица; раса/етническа принадлежност; и кръвно налягане (средно шест показания).

Биопсия на мастната тъкан и анализ на размера на клетките

Мастната тъкан се получава при стерилни условия с прилагане на 0,25 бупивокаин с адреналин (епинефрин) за локална анестезия. Направен е разрез на скалпел от 1 см по-нисък от пъпа, от който са отстранени 2 g подкожна мастна тъкан. Две проби от 20–30 mg тъкан веднага се фиксират в осмиев тетроксид и се инкубират във водна баня при 37 ° C в продължение на 48 часа, както е описано по-горе [14], а след това размерът на мастните клетки се определя от Beckman Coulter Multisizer III с Апертура 400 μm. Обхватът на размерите на клетките, които могат ефективно да се измерват с помощта на този отвор, е 20–240 μm. Инструментът е настроен да отчита 6000 частици и суспензията с фиксирани клетки се разрежда така, че броенето на съвпадения да е Фиг. 1

клетки

Мултизаторни мастни клетъчни профили на инсулиноустойчиви (а) и чувствителни към инсулин (б) субекти, начертаващи диаметъра на клетката, използвайки линейни контейнери спрямо относителна честота. AUC се нормализират до 1.0 и честотните профили се отрязват при у = 0,06 за яснота. Надирът е най-ниската точка (по честота) между двете клетъчни популации, т.е. когато кривата между двете популации е равна, средната точка е обозначена като най-ниската. Диаметърът на върха е средният диаметър на клетките над надира или „големите“ клетки. Стрелките показват средствата за надира (наляво) и диаметър на върха (нали) за всяка група

Количествена PCR в реално време за маркери на диференциация на мастните клетки

Статистически анализ

Student’s unpaired т тестове или χ2 тест (за категорични променливи) са използвани за сравняване на клиничните и лабораторни характеристики между двете групи и за оценка на първичните крайни точки по отношение на разпределението на размера на клетките между двете групи. Тези крайни точки бяха надирът, съотношението на малките към големите клетки и диаметърът на върха на популацията на големите клетки. Потенциални объркващи фактори (пол, ИТМ или обиколка на талията и упражнения) бяха въведени в анализа на ковариационни модели (ANCOVA), при които крайните точки на разпределение на размера на клетките бяха зависими променливи, а инсулиноустойчивата група беше основната променлива за групиране, с корекция на Scheffe за множество сравнения. Сравненията на относителната генна експресия, определена чрез PCR в реално време (по-долу), бяха сравнени с несдвоените Student's т тестове. Тези анализи са извършени с помощта на Systat 10.0 (SPSS, Чикаго, IL, САЩ).

Допълнителни количествени анализи бяха извършени чрез математическо моделиране (нелинейна функция на най-малките квадрати nls, R 1.9; достъпно от: http://www.r-project.org, последно достъпно през май 2007 г.), при което една формула, използваща седем параметъра с размер на клетката могат да опишат отделните точки от данни за всеки субект:

където х = диаметър на клетката и х 0 = най-малкият диаметър; з 1 и w 1 = височина и ширина на първия експоненциален; з 2 и w 2 = височина и ширина на втория експоненциален; и з стр, ° С p и w p = височина, център и ширина на гауссовата крива. В кривата, формулирана от това уравнение, малките клетки са представени от сумата от два експоненциални показателя, а големите клетки са представени от гауссова крива (Електронен допълнителен материал [ESM] Фиг. 1). Композитната разлика между профилите на кривите на двете групи беше оценена чрез дисперсионен мултивариантен анализ (MANOVA). Разликите между групите за всеки от седемте параметъра за размер на клетките в уравнението бяха оценени чрез несдвоени Student’s т тест. За всички анализи, a стр стойност равна или по-малка от 0,05 се счита за статистически значима.

Резултати

На тринадесет инсулиноустойчиви и 15 чувствителни към инсулин пациенти с наднормено тегло или затлъстяване са били подложени на биопсия на мастната тъкан. Клиничните и лабораторни характеристики на двете субектни групи са показани в Таблица 1. При подбора разликата в инсулиновата резистентност е драматична, като средният SSPG в инсулинорезистентната подгрупа е приблизително три пъти по-голям от стойностите в инсулиночувствителната подгрупа. Също така чрез подбор, двете групи бяха добре съчетани по отношение на ИТМ (30,6 ± 4,1 срещу 29,4 ± 2,7) и обиколка на талията (102 ± 12 срещу 989). Не са наблюдавани статистически значими разлики между групите по отношение на възраст, пол, отчетени нива на упражнения, кръвно налягане, глюкоза на гладно или общ холестерол или LDL-холестерол. Плазмените концентрации на триацилглицерол са по-високи, а концентрациите на HDL-холестерол са по-ниски при инсулинорезистентните затлъстели участници.

Фигура 1 илюстрира разпределението на размера на мастните клетки на всички 28 субекта, както е определено чрез Multisizer анализ, използващ клетки, изолирани от фиксирана с осмий мастна тъкан. Разпределението на мастните клетки е бимодално при всеки субект в резултат на променлива, но като цяло голяма част от малките клетки. Това, че малките клетки, идентифицирани от Multisizer, са били наистина мастни клетки, се подкрепя от сканираща електронна микроскопия както на фиксирана с параформалдехид тъкан, така и на фиксирани с осмий клетки, обработени за Multisizer анализ, показано на фиг. 2, което ясно показва наличието на малки мастни клетки, които се появяват като сферични обекти, заедно със стромални съдови клетки (пръчковидни или пръстоподобни клетки, само фиг. 2а) и моноцити (много малки обекти, прилепнали към сферично оформените мастни клетки). За да потвърдим количествено, че популацията от малки клетки наистина е мастна клетка, ние направихме директно количествено сравнение на разпределението на размера на клетките на фиксирани с осмий клетки, приготвени чрез фиксиране на тъканите, и тези, приготвени чрез фиксиране на изолирани мастни клетки, получени чрез флотационния метод от същата тъканна биопсия. Графиките на фиг. 3 показват, че кривите на разпределение на изолираните клетки се доближават до тези на мастната тъкан.

Фотографски примери на човешки мастни клетки с много различен размер на клетките. а Сканираща електронна микрография на фиксирана с параформалдехид тъкан, показваща малки и много малки мастни клетки (стрелките показват клетки с диаметър приблизително 45 и 10 μm). б Сканираща електронна микрография на фиксирани с осмий клетки, показващи големи и малки мастни клетки

Многопрофилни профили на разпределението на размера на мастните клетки на биопсични проби от непокътната мастна тъкан (отворени кръгове) и изолирани мастни клетки (затворени кръгове) от една и съща тъкан на два различни субекта

Таблица 2 представя средната, средната стойност и режима на диаметъра на мастните клетки в групите, чувствителни към инсулин и инсулин. Въпреки че тези стойности не се различават значително между двете групи, инсулинорезистентната група се характеризира с по-висок надир (72 ± 13 срещу 59 ± 10 μm, стр Таблица 2 Разпределение на размера на мастните клетки при инсулиноустойчиви срещу чувствителни към инсулин индивиди със затлъстяване

Мултизаторни профили на размера на мастната клетка, като се използват средните параметри от формулата за приспособяване на кривата за чувствителни към инсулин (плътна линия) и резистентни към инсулин (прекъсната линия) субекти (стр = 0,03 с използване на MANOVA)

За да се изследва възможността малките мастни клетки при инсулиноустойчивите субекти да представляват относително недиференцирани мастни клетки, измерихме относителната експресия на гени, свързани с диференциацията на мастните клетки в двете подгрупи (шест инсулиноустойчиви и пет инсулиноустойчиви участници). Четири от шестте инсулиноустойчиви и четири от петимата инсулиноустойчиви участници бяха включени в анализа на размера на клетките. Демографските/метаболитни характеристики на инсулинорезистентните спрямо инсулиночувствителните групи в този анализ са както следва: SSPG 12,72 ± 2,17 срещу 3,44 ± 0,56 mmol/l (стр 2 (стр = 0,15); обиколка на талията съответно 100 ± 13 срещу 97 ± 14 cm (p = 0,75). Таблица 3 показва, че експресията на гените, кодиращи диференциращите фактори SREBP1c, PPARγ1 и PPARγ2, и зрелите клетъчни протеини адипонектин и GLUT4 са били поне два пъти по-високи в чувствителната към инсулин група.

Дискусия

Ние интерпретираме тези данни, за да предположим, че инсулиновата резистентност при затлъстели индивиди се появява не защото те имат по-големи мастни клетки, както беше предложено по-рано [13, 15], а по-скоро, поне отчасти, в резултат на неспособността им да реагират на трябва да съхранява излишната енергия (триацилглицерол) чрез увеличаване на производството на напълно диференцирани, зрели мастни клетки. Открихме увеличение на дела на малките мастни клетки, което предполага, че клетките-предшественици натрупват достатъчно триацилглицерол, за да бъдат обозначени като мастни клетки чрез плаване или относителни размери, но не могат да функционират допълнително в процеса на съхранение на триацилглицерол, в съответствие с наблюденията, че инсулиноустойчивите индивиди имат относително по-големи количества мазнини, съхранявани в черния дроб и скелетните мускули [25, 26]. В допълнение, относителната липса на зрели мастни клетки може да бъде свързана с аномалии в секрецията на крайни протеини, получени от адипоцити, като адипонектин, които координират мастните клетки и системния метаболизъм. Наистина, нашите открития са в съответствие с предходен доклад, показващ, че плазмените концентрации на адипонектин са значително по-ниски при индивиди със затлъстяване, инсулинорезистентни, в сравнение с индивиди, чувствителни към инсулин с подобно затлъстяване [27].

На молекулярно ниво нашите констатации се подкрепят от няколко доклада. Първо, беше демонстрирано в 3T3-L1 адипоцитна културна клетъчна система, че съвместното култивиране с възпалителни цитокини IL-6 и TNF-α позволява ранна диференциация, но предотвратява узряването до крайния етап [28]. Тези дисфункционални адипоцити натрупват по-малко триацилглицерол и изразяват възпалителен фенотип. В друг доклад мастната тъкан от пациенти с свързана с HIV-1 липоатрофия показва намалена диференциация и повишено възпаление в сравнение с контролите, заедно с инсулиновата резистентност [29]. Не измерихме количествено възпалителните маркери в това проучване, но би било полезно при бъдещи изследвания на човешкото затлъстяване да се определи дали разликите в размера на клетките и/или диференциацията са свързани с възпаление на молекулярно ниво, особено тъй като по-рано показахме, че няколко циркулиращи възпалителните маркери варират в зависимост от инсулиновата чувствителност, независимо от затлъстяването [30, 31].

Нашите резултати и техните постулирани патофизиологични последици са в съответствие с моделите на липодистрофия при хора и животни, при които почти абсолютната липса на подкожна мастна тъкан е свързана с инсулинова резистентност, придружена от повишено отлагане на триацилглицерол в мускулите и черния дроб [36, 37]. По същия начин може да се твърди, че развитието на затлъстяване при лица, които поради все още неясни причини имат дефект в способността си да увеличават съхранението на триацилглицерол на мастните клетки чрез увеличаване на популацията на напълно диференцирани мастни клетки, ще бъдат по-устойчиви на инсулин, отколкото еднакво затлъстели лица, които са запазили тази способност. Нашите резултати също така дават потенциално обяснение за механизма, чрез който съединенията на тиазолидендиона могат да усилят инсулиновото действие в скелетните мускули: чрез стимулиране на диференциацията на мастните клетки [38], дезадаптивните метаболитни последици от относителния дефицит в способността да се съхранява триацилглицерол в мастната тъкан се подобряват, с последващо намаляване на съдържанието на мазнини в черния дроб [39] и скелетните мускули [40].

Нашето проучване е ограничено от малкия си размер. Освен това не можем да докажем причинно-следствената връзка, а просто да докладваме за асоциации в това изследване върху хора. Имайте предвид, че ние не твърдим, че малките клетки се различават от големите по отношение на генната експресия и метаболизма на мазнините. По-скоро предлагаме да съществуват разлики между мастните клетки при чувствителни към инсулин и инсулиноустойчиви субекти, които са свързани с количествено измерима разлика в разпределението на размера на клетките. Може да съществуват допълнителни метаболитни разлики между малките и големите клетки, които биха могли да допринесат за въздействието върху метаболизма на цялото тяло на разликите в разпределението на размера на клетките, но такова определяне ще изисква по-нататъшна работа за разделяне на клетките по размер.

Настроихме се за възможни объркващи ефекти от леки разлики в ИТМ и обиколката на талията, както и пола и упражненията. Нашите учебни предмети бяха предимно бели и следователно резултатите ни може да не са общи за всички расови групи. И накрая, тъй като участниците в нашето проучване бяха достъпни само за биопсия на подкожна мастна тъкан, не можахме да оценим приноса на висцералната мастна тъкан към инсулиновата резистентност. Паралелните проучвания при гризачи обаче показват, че подобно разпределение на размера на мастните клетки се прилага в депата (D.G. Hunt, X. Chen, M. Santos, N. Tserentsoodol, S. Cushman; непубликувани резултати). Силните страни включват характеризиране на две подобни групи с наднормено тегло, които се различават метаболитно, и използването на по-нова технология за характеризиране на разпределението на размера на клетките по по-сложен начин.