От Центъра за сърдечно-съдови и белодробни изследвания, Колумб, Охайо (D.J.H., H.L.H., J.L.); The Heart Center, Nationwide Children's Hospital, Columbus, OH (D.J.H., H.L.H., J.L.); Завършила програма за молекулярна и клетъчна фармакология, Медицински факултет на Леонард М. Милър, Маями, Флорида (D.J.H.); Висше училище по биомедицински науки, Институт по биоматериали и биоинженерство, Токийски медицински и дентален университет, Токио, Япония (H.K.); и катедра по педиатрия, Университета на Охайо, Колумб, Охайо. (J.L.).

От Центъра за сърдечно-съдови и белодробни изследвания, Колумб, Охайо (D.J.H., H.L.H., J.L.); The Heart Center, Nationwide Children's Hospital, Columbus, OH (D.J.H., H.L.H., J.L.); Завършила програма за молекулярна и клетъчна фармакология, Медицински факултет на Леонард М. Милър, Маями, Флорида (D.J.H.); Висше училище по биомедицински науки, Институт по биоматериали и биоинженерство, Токийски медицински и дентален университет, Токио, Япония (H.K.); и катедра по педиатрия, Университета на Охайо, Колумб, Охайо. (J.L.).

От Центъра за сърдечно-съдови и белодробни изследвания, Колумб, Охайо (D.J.H., H.L.H., J.L.); The Heart Center, Nationwide Children's Hospital, Columbus, OH (D.J.H., H.L.H., J.L.); Завършила програма за молекулярна и клетъчна фармакология, Медицински факултет на Леонард М. Милър, Маями, Флорида (D.J.H.); Висше училище по биомедицински науки, Институт по биоматериали и биоинженерство, Токийски медицински и дентален университет, Токио, Япония (H.K.); и катедра по педиатрия, Държавният университет в Охайо, Колумб, Охайо. (J.L.).

От Центъра за сърдечно-съдови и белодробни изследвания, Колумб, Охайо (D.J.H., H.L.H., J.L.); The Heart Center, Nationwide Children's Hospital, Columbus, OH (D.J.H., H.L.H., J.L.); Завършила програма за молекулярна и клетъчна фармакология, Медицински факултет на Леонард М. Милър, Маями, Флорида (D.J.H.); Висше училище по биомедицински науки, Институт по биоматериали и биоинженерство, Токийски медицински и дентален университет, Токио, Япония (H.K.); и катедра по педиатрия, Университета на Охайо, Колумб, Охайо. (J.L.).

Преглеждате най-новата версия на тази статия. Предишни версии:

Резюме

Обективен-

Калцифната болест на аортната клапа (CAVD) е основен проблем за общественото здраве, без друго ефективно лечение освен операция. По-рано показахме, че зрелите сърдечни клапи се калцират в отговор на лечението с ретиноева киселина (RA) чрез понижаване на регулационния фактор на SRY транскрипция Sox9. В това проучване ние изследвахме ефектите на излишния витамин А и неговия метаболит RA върху структурата и функцията на сърдечната клапа in vivo и изследвахме молекулярните механизми на сигнализиране на RA по време на процеса на калциране in vitro.

Методи и резултати—

Използвайки комбинация от подходи, дефинирахме патогенезата на калциалната аортна клапа при мишки, хранени с 200 IU/g и 20 IU/g ретинил палмитат в продължение на 12 месеца на молекулярно, клетъчно и функционално ниво. Ние показваме, че мишките, хранени с излишен витамин А, развиват стеноза на аортната клапа и калцификация на листовките, свързани с повишена експресия на остеогенни гени и намалена експресия на хрущялни маркери. Използвайки фармакологичен подход, ние показваме, че е медиирано от RA Sox9 репресията и калцирането се регулират от класическата RA сигнализация и изискват както RA, така и ретиноидни X рецептори.

Заключение—

Нашите проучвания показват, че излишъкът от прием на витамин А с диета насърчава калцификацията на сърдечната клапа in vivo. Следователно предполагаме, че хипервитаминозата А може да служи като нов рисков фактор за калциална аортна клапа в човешката популация.

Въведение

Ретиноевата киселина (RA) е активният метаболит на витамин А (ретинол), който се доставя в организма от хранителни източници, предимно под формата на каротеноиди. Веднъж попаднали в кръвообращението и прицелните тъкани, активните ретиноиди функционират като сигнални молекули, за да определят клетъчната идентичност и да контролират генната експресия. 17 RA сигнала чрез специфични ядрени рецептори, включително семейства RA рецептор (RAR) и ретиноид X рецептор (RXR), които се състоят от 3 изоформи: α (a), β (b) и γ (g). 18 Сигнализирането чрез тези рецептори участва в много ключови клетъчни процеси, включително диференциация на клетките, контрол на клетъчния цикъл, клетъчен растеж и клетъчни реакции на нараняване и е замесено в патогенезата на затлъстяването, захарния диабет и сърдечно-съдовите заболявания. 19 Най-фундаменталният механизъм на действие на ретиноидите е чрез транскрипционно регулиране на ядрените рецептори, реагиращи на RA, което зависи от образуването на димери. RXR може да сигнализира като хомодимер или да действа като хетеродимерен партньор за други ядрени рецептори, като RAR или витамин D рецептори. След това тези комплекси се свързват със специфични елементи на отговор, включително RA елементи с отговор, разположени в подобрителни региони на целевите гени, за да модулират положителната и отрицателната функция. 18.

Материали и методи

Див тип C57BL/6J мишки са били хранени или с обикновена чау-смес, съдържаща 20 IU/g ретинол като ретинил палмитат (Harlan, TD.93160), или с модифициран излишък на витамин A, съдържащ 200 IU/g ретинил палмитат (Harlan, TD.110146) за период от 12 месеца и подложени на ехокардиография, както е описано. 40 След функционален анализ, РНК се извлича от аортни клапи или цели сърца и се образува кДНК за количествена полимеразна верижна реакция в реално време, както е описано. 37 Алтернативно, цели сърца са фиксирани и секционирани за хистологично оцветяване, както е описано. 40 За in vitro проучвания, постнатални мишки или ембрионален ден (E) 10 експлантата на митрална и аортна клапа на пилета бяха третирани с ATRA (Sigma, 1 µmol/L), 9-cis-RA (Enzo, 1 µmol/L), LE540 ( 100 µmol/L), PA452 (100 µmol/L), AM580 (Tocris Bioscience, 1 µmol/L), адапален (Tocris Bioscience, 10 µmol/L) или диметил сулфоксид (DMSO; 0.001% крайна концентрация) за 48 часа . След това на стъклени предметни стъкла се монтират екстракти и се фиксират за хистологично оцветяване или се извлича РНК за анализ на микрочипове с помощта на Affymetrix Mouse GeneST Array. За пълно описание на материалите и методите вижте онлайн добавка за данни.

Резултати

Дългосрочният излишък от диетичен витамин А насърчава стенозата на аортния клапан и калцификацията

хранителен

RA-медиирана калцификация изисква активност както на RAR, така и на RXR

Констатации от in vivo проучвания при мишки (Фигура 1) и публикуваната ни преди това in vitro работа 37 подкрепят хипотезата, че повишената RA сигнализация насърчава калцирането на сърдечната клапа. За допълнително очертаване на това и определяне на молекулните механизми, необходими за този процес, беше изследван приблизителният абсолютен брой на транскриптите на RAR и RXR изоформите в постнаталните миши аортни и митрални клапи, както и сравними етапи в пилето (ембрионален [E] ден 10 ) (Фигура 2). В клапите на мишките се идентифицират сравними нива на изоформите на RA рецептора в митралните и аортните клапани, с RARα (RARa) като е най-силно изразена (Фигура 2А). За разлика, RARb и RARγ (RARg) са най-преобладаващи в пилешките клапани (Фигура 2Б). Защото RXRa и RXRb изоформи не са докладвани в системата на птиците, те не са включени в този анализ.

Фигура 2. Изоформите на рецептора на ретиноева киселина са силно експресирани в аортна и митрална клапа на мишка и пиле. Количествена полимеразна верижна реакция в реално време за показване на приблизителни абсолютни числа на транскрипти на различни RAR и ретиноидни X рецептори (RXR) изоформи в постнатална мишка (A), и ембрионален ден 10 пиле (Б.) аортни (AoV) и митрални (MV) клапани.

За да се определи дали RA функционира чрез класическа RA рецепторна сигнализация за насърчаване на калцификация, експлантатите на птичи, миши аортни и митрални клапи са лекувани с различни фармакологични RAR и RXR агонисти и антагонисти (Фигура 3А). При умерени концентрации е показано, че ATRA е избираем агонист за RARs, докато 9-cis активира както RARs, така и RXRs (Фигура 3А). 17 Що се отнася до антагонистите, LE540 е утвърден пан-антагонист за RARs и PA452 е известно, че инхибира RXR функцията (Фигура 3А). 47 За да се определи ефективността на действието на агонист и антагонист върху RAR и RXR активността, количествената полимеразна верижна реакция беше използвана за определяне на нивата на иРНК на RAR/RXR-медиирания RA целеви ген, RARb. 45 Както се очаква, ATRA и 9-цисът значително се увеличават RARb израз върху управлението на превозното средство (Фигура 3Б). За да се изследват относителните нива на инхибиране от антагонистите в тази система, агонистичната активност е определена на 100%. Използвайки този подход, наблюдаваме, че лечението с LE540 инхибира ATRA- и 9-цис-медиираната активност на RAR до 32,95 ± 4,93% и 38,28 ± 5,72%, съответно (Фигура 3С). За PA452, съвместното лечение намалява RXR активността до 53.32 ± 9.27%, докато лечението както с LE540, така и с PA452 инхибира активността до 5.11 ± 0.05% (Фигура 3D). Тези проучвания потвърждават планираното фармакологично активиране и инхибиране на RAR и RXR.

Фигура 3. Изцяло транс-ретиноевата киселина (ATRA) калцификация на сърдечната клапа изисква активност на рецептора на ретиноева киселина (RAR) и ретиноиден X рецептор (RXR). експлантите на митралната клапа на cE10 бяха третирани в продължение на 48 часа с посочени агонисти, със или без 4-часово предварително лечение с антагонист. A, Диаграма, изобразяваща селективност на RAR и RXR агонисти и антагонисти. Б. и ° С, Количествена полимеразна верижна реакция за показване на промени в RARb израз (Б., ° С) като гъвкава промяна при лечение с агонист (Б.) и като процентна промяна след предварителна обработка с RAR (LE540) или RXR (PA452) пан-антагонисти в сравнение с ATRA и 9-цис агонисти само. д, Количествен анализ на верижната реакция на полимераза, за да покаже процентни промени в Sox9 експресия в агонистично лечение самостоятелно и предварително лечение с антагонисти. *P

Както предишните ни проучвания показаха, че лечението с ATRA насърчава калцирането чрез потискане на Sox9 37, след това разгледахме промените в Sox9 експресия в отговор на лечение с агонист и антагонист. Както е показано на фигура 3D, както ATRA, така и 9-цисът значително потискат Sox9 експресия в експлантати на аортна клапа на птичи E10 и тази репресия се облекчава до нива, сравними с контролите на превозното средство, когато се обработват с LE540. По същия начин при 9-цис, LE540 или PA452 лечения значително предотвратяват 9-цис-медиирани Sox9 репресия, въпреки че лечението с двата антагониста е най-ефективно (Фигура 3D). Подобни наблюдения бяха наблюдавани при използване на siRNA за насочване на RAR, RXR или както на RAR, така и на RXR нокдаун в клетки C3H10T1/2, третирани с ATRA, в сравнение с DMSO и нецелеви siRNA контроли (Фигура I в онлайн само Допълнение към данни). Тези данни предполагат, че RAR и RXR са необходими за посредничество Sox9 репресия и калцификация чрез активирана RA сигнализация. Съответства на намалената Sox9 експресия на Фигура 3, реактивността на von Kossa, показателна за калциране, се увеличава значително при лечение с ATRA и 9-цис на експланти на митрална клапа на птиците и този фенотип се губи, когато се обработва с LE540, PA452 или и двата антагониста (Фигура 4).

Фигура 4. Лечението с ретиноева киселина насърчава образуването на калциеви възли в експланти на митрална клапа на cE10. В сравнение с управлението на превозното средство (A), реактивността на von Kossa се повишава след лечение с изцяло транс-ретиноева киселина (ATRA) (Б.) и 9-цис RA (Е.). реактивността на von Kossa се отслабва, когато се лекува с фармакологични антагонисти (° С, д, F-З.). Аз, Количественото определяне на реактивността на фон Коса, нормализирано към площта, както е показано от Alcian blue counterstain. DMSO показва диметил сулфоксид. *P

RARa и RARb, g Агонистично лечение на пневматични клапи Експресира репресии Sox9 и Col2a1 Изразяване и насърчаване Spp1

Фигура 5. Лечението със специфични изоформени агонисти на рецептора на ретиноева киселина (RAR) насърчава експресията на остеогенни гени за сметка на хрущялни маркери. A, Количествена полимеразна верижна реакция за показване на гъвкави промени в RARb експресия след третиране на cE10 или постнатални миши аортни клапи (AoV) експланти с RARa- (AM580) и RARb, g, -специфични (адапален) агонисти по отношение на контрола на носителя. Б. и ° С, Количествена полимеразна верижна реакция за показване на промени в остеогенната (Spp1) и хрущялни (Sox9, Col2a1) генна експресия след лечения. *P

Анализът на микрочипове разкрива значителни промени в профилите на генна експресия, свързани с развитието на костите и ECM в миши аортни сърдечни клапи след краткотрайно лечение с ATRA

Таблица. Анализ на генна онтология на данни от микрочипове за лекувани с ATRA екстракти на аортния клапан в сравнение с DMSO Vehicle Controls показва обогатяване на костното развитие и генните програми на извънклетъчната матрица

ATRA показва изцяло транс-ретиноева киселина; и DMSO, диметил сулфоксид.

Дискусия

В това проучване ние определихме ефектите от излишния хранителен витамин А върху структурата и функцията на сърдечната клапа и изследвахме сигналните механизми, лежащи в основата на предизвиканите от RA промени в профилите на генната експресия на клапаните. Ние показваме, че дългосрочната хипервитаминоза А при мишки води до стеноза на аортната клапа и калцификация на листовките, свързани с повишени профили на експресия на остеогенни гени in vivo. Използвайки установена in vitro система за експлантация на клапан, ние също установихме, че индуцираният от RA калцификат сигналира чрез RAR и RXR и води до Sox9 репресията и дисрегулацията на неговите целеви гени, включително намалява Col2a1 и се увеличи Spp1. В подкрепа на това, генният онтологичен анализ на находките от микрочипове показва, че наборите от генни експресионни сонди, свързани с развитието на костите и ECM процесите, са обогатени с експланти на миши аортен клапан, третирани с ATRA. Тези резултати предполагат, че RA сигнализирането трябва да бъде строго регулирано при възрастни мишки, за да се поддържа хомеостазата на съединителната тъкан на сърдечната клапа. Освен това констатациите от това проучване показват, че излишното излагане на ретиноиди може да допринесе за появата и прогресирането на CAVD в човешката популация.

Излишният хранителен прием на витамин А насърчава дисфункцията на клапата при мишките

RA лечението насърчава остеогенни и потиска хрущялоподобни процеси в съединителната тъкан на възрастни сърдечни клапи

Хипервитаминоза А като модел на CAVD

Обобщение и клинични перспективи

Благодарности

Благодарим на Blair Austin, Agata Levay и Ge Tao за техническата помощ и д-р T. Michael Underhill за споделянето на реагенти. В допълнение, благодарим на д-р Дейвид Уилоуби (Ocean Ridge Biosciences, LLC) за извършването на изследването на микрочиповете.